基于質(zhì)譜裂解機(jī)理的深加工羊肉制品中獸藥殘留非定向篩查技術(shù)研究

賈 瑋，徐 曦，石 琳，賀 博，樊 成，儲曉剛,4

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制重點實驗室，陜西 安康 725000；3.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710048；4.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，獸藥被添加到飼料中以預(yù)防與治療動物疾病，導(dǎo)致藥物殘留通過生物食物鏈富集進(jìn)而危害人體健康[1]。近年來，深加工肉類制品因具有流通效率及附加值高等優(yōu)勢而備受青睞[2]。我國雖是羊肉生產(chǎn)大國，但我國羊肉類產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化程度較低，檢疫制度尚不健全，且受技術(shù)性壁壘影響，亟待發(fā)展深加工羊肉制品中獸藥的高通量測定方法[3]。

目前，食品中獸藥殘留分析主要以靶向篩查為主，非定向篩查尚未建立系統(tǒng)的鑒定體系[4-5]。由于獸藥種類及代謝物繁多，類別間差異大，應(yīng)用傳統(tǒng)色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行靶向分析通常依賴離子通道信息在目標(biāo)物選定范圍內(nèi)識別分析物，易造成假陽性結(jié)果，且對復(fù)雜基質(zhì)缺乏抗干擾能力。高分辨質(zhì)譜具有高靈敏度、高選擇性及良好的重現(xiàn)性，可通過獸藥分子離子精確質(zhì)量數(shù)和高分辨碎片離子對非定向目標(biāo)物進(jìn)行篩查[4]。而基于高分辨質(zhì)譜的非定向分析依據(jù)目標(biāo)物分布的質(zhì)荷比范圍，可動態(tài)調(diào)整每個窗口的寬度，對分析物信息均勻地采集，能夠?qū)崿F(xiàn)一次運行中獲得大量的目標(biāo)物，并精準(zhǔn)確認(rèn)詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，以提高方法的選擇性[6]。

本文運用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS)在全掃描數(shù)據(jù)非依賴篩查(Full MS/dd-MS2)模式下建立34種獸藥的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，對7類(磺胺類、四環(huán)素類、苯并咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類)獸藥的特征片段及斷裂規(guī)律進(jìn)行研究。采用全掃描數(shù)據(jù)非依賴采集(Full MS/vDIA)模式結(jié)合已知的特征碎裂片段建立深加工羊肉制品中獸藥殘留的非定向篩查方法，以完善深加工肉類制品的質(zhì)量安全檢測方法體系。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UltiMate 3000-Q-Exactive超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜；AL204-IC型分析天平；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Vortex Genie2T型旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16C型高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純)購自德國Merck公司；34種標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于99%)購自德國Dr.Ehrenstofer公司；無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水乙酸鈉、氯化鈉(美國Sigma公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18(美國Welch公司)；預(yù)包裝羊肉卷等系列深加工羊肉制品購自西安市本地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃冷凍保存；移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃保存；用空白樣品提取液逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理提?。悍Q取絞碎均勻的羊肉樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中，分別加0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(檸檬酸緩沖液)、1%甲酸-乙腈溶液各5 mL,振蕩提取2 min，5 000 r/min離心5 min，收集上清液；殘渣中再分別加入5 mL提取液，于20 ℃超聲水浴中20 min后，離心5 min。

凈化：合并兩次提取上清液，加入2 g無水硫酸鎂、3 g無水乙酸鈉和3 g氯化鈉渦旋1 min，7 000 r/min離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一試管中，加入470 mg C18、430 mg PSA及200 mg無水硫酸鈉，渦旋混勻后以8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，上機(jī)測定。

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件色譜條件：色譜柱為Inertsil ODS3-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：A為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸-4 mmol/L甲酸銨溶液，B為0.1%甲酸-4 mmol/L甲酸銨-甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，100% A；1～7 min，100%～0% A；7～12 min，0% A；12～13 min，0%～100% A；13～15 min，100% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)；全掃描模式與數(shù)據(jù)非依賴采集模式；毛細(xì)管電壓：3 500 V；碰撞氣：N2；干燥氣流量：13 L/min；離子源溫度：350 ℃；鞘氣流量：12 L/min；輔助氣流量：3 L/min；采集范圍：m/z100～1 500；全掃描模式質(zhì)譜分辨率：60 000 FWHM，二級質(zhì)譜分辨率：17 500 FWHM。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)庫的建立

按照“1.2.1”，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在Full MS/dd-MS2模式下建立標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。采集的信息主要包括分子離子質(zhì)荷比(理論值)、二級碎裂片段的質(zhì)荷比與保留時間。本實驗分子離子的離子化形式主要為[M+H]+，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性，每種化合物平均進(jìn)樣6次，各化合物準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)量數(shù)測定的相對偏差均小于5×10-6。以密度泛函理論為基礎(chǔ)，結(jié)合Mass Frontier軟件，基于電離模式與結(jié)構(gòu)式推測碎片的斷裂途徑，篩選出響應(yīng)值高的特征碎裂片段，依據(jù)元素構(gòu)成閾值推算質(zhì)譜裂解反應(yīng)生成碎裂片段的理論值，并建立目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫[7]。

應(yīng)用mzVault軟件對標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)管理，用于化合物名稱、分子式、質(zhì)荷比等的譜圖檢索。34種化合物的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫信息如表1所示。

2.2 片段碎裂特征及其在獸藥殘留篩查中的應(yīng)用

2.2.1 斷裂機(jī)理研究實驗對7類獸藥的二級質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行研究，獲得了34種化合物的片段裂解途徑，以喹諾酮類的恩諾沙星為例，其裂解途徑如圖1所示。恩諾沙星的分子離子質(zhì)荷比理論值為m/z360.171 80，該化合物在電噴霧質(zhì)譜中的裂解過程主要為電子遷移反應(yīng)、電荷中心誘導(dǎo)的鍵斷裂(i斷裂)和遠(yuǎn)端重排反應(yīng)(rHR)。在ESI+狀態(tài)下，正電荷中心位于喹諾酮萘啶環(huán)結(jié)構(gòu)的取代基原子上，加氫離子峰m/z360.17 180[M+H]+經(jīng)i斷裂，在正電荷的吸引下，使連接在N原子上的單鍵斷裂，m/z360.171 80中性丟失1分子C8H5N，形成碎片離子m/z245.108 47[M+H-C8H5N]+；m/z72.080 78碎片來源于哌嗪環(huán)另一種重排方式，m/z360.171 80中性丟失1分子C18H10O3N形成碎片離子[M+H-C18H10O3N]+；m/z360.171 80與m/z342.162 32相比減少了18 Da，是由準(zhǔn)分子離子進(jìn)行γ位氫原子重排反應(yīng)異構(gòu)化后中性丟失1分子H2O，得到m/z342.161 23[M+H-H2O]+脫水碎片離子。

圖1 恩諾沙星的斷裂機(jī)理Fig.1 Fragmentation mechanism of enrofloxacin

CategoriesCompoundMolecular formulaRetention time/minPrecursor(m/z)Fragment 1(m/z)Fragment 2(m/z)β-LactamsAmoxicillin(阿莫西林)C16H25N3O8S3.87366.111 63193.061 05160.042 97(β-內(nèi)酰胺類)Cefapirinsdium(頭孢匹林鈉)C17H17N3NaO6S24.16424.063 05364.041 99320.050 90Ampicillin(氨芐青霉素)C16H19N3O4S3H2O4.97350.116 67333.091 19305.095 40Penicillin G(青霉素 G)C16H18N2O4S6.26335.105 65317.095 49220.042 863,5-Dinitro-o-toluamide(3,5-二硝基鄰甲酰胺)C8H7N3O55.16224.031 43181.025 5641.998 54ChloramphenicolsThiamphenicol(甲砜霉素)C12H15Cl2NO5S4.53353.998 17335.987 09185.027 69(氯霉素類)Florfenicol(氟苯尼考)C12H14Cl2FNO4S5.03355.993 84272.040 62185.027 69Tetracyclines(四環(huán)素類)Oxytetracycline hydrochloride(鹽酸土霉素)C22H25ClN2O95.78461.155 61337.060 68226.071 27SulfonamidesSulfadiazine(磺胺嘧啶)C10H10N4O2S4.08251.059 75158.004 64156.011 47(磺胺類)Sulfathiazole(磺胺噻唑)C9H9N3O2S24.25256.020 97156.011 52140.016 37Sulfadimethoxine(磺胺二甲氧噠嗪)C12H14N4O4S5.65311.080 87279.054 64218.024 19Sulfamethazine(磺胺二甲嘧啶)C12H14N4O2S4.70279.091 09186.033 05156.011 51Sulfamethoxypyridazine(磺胺甲氧噠嗪)C11H12N4O3S4.80281.070 28263.035 91156.011 44QuinolonesMarbofloxacin(麻保沙星)C17H19FN4O44.88363.146 31344.948 09319.912 90(喹諾酮類)Enoxacin(依諾沙星)C15H17FN4O35.01321.135 89303.125 40293.105 19Norfloxacin(諾氟沙星)C16H18FN3O35.01320.140 59302.130 10282.122 77Danofloxacin(達(dá)氟沙星)C19H20FN3O35.19358.156 10342.161 71340.145 05Ciprofloxacin(環(huán)丙沙星)C17H18FN3O35.20332.140 47314.129 79312.133 91Enrofloxacin(恩諾沙星)C19H22FN3O35.23360.171 80342.160 86316.181 55Lomefloxacin(洛美沙星)C17H19F2N3O35.25352.146 85334.136 72324.116 21Tilmicosin(替米考星)C46H80N2O136.29879.573 67696.467 22678.458 98BenzimidazolesThiabendazole(噻苯咪唑)C10H7N3S5.17202.043 92187.032 45175.032 45(苯并咪唑類)Mebendazole(甲苯咪唑)C16H13N3O36.70296.103 06264.076 67236.081 04Oxfendazole(奧芬達(dá)唑)C15H13N3O3S6.10316.075 13284.048 77175.037 75Thiabendazole(噻苯咪唑)C10H7N3S6.30202.043 92187.032 45175.032 45Oxibendazole(丙氧苯咪唑)C12H15N3O36.35250.118 62218.092 39208.071 64MacrolidesTylosin(泰樂菌素)C46H77NO176.46916.526 43174.101 84772.501 13(大環(huán)內(nèi)酯類)9-Amino-9-deoxoerythromycin(紅霉胺)C37H70N2O125.96735.504 37158.125 47577.402 43Oleandomycin(竹桃霉素)C41H67NO146.51688.427 31544.348 82158.117 78Erythromycin A(紅霉素A)C37H67NO136.94734.468 52576.230 32716.210 12Tylosin tartrate(酒石酸泰樂菌素)C50H83NO236.70916.526 86772.501 13174.101 84Erythromycin(紅霉素)C37H67NO136.81734.468 93576.374 94558.363 65Roxithromycin(羅紅霉素)C41H76N2O156.94837.531 85158.102 12679.413 52Lincomycin(林可霉素)C18H37ClN2O7S7.37371.219 36386.186 99346.131 88

2.2.2 片段斷裂特征離子在不同能量下與高純度N2碰撞，片段斷裂具有規(guī)律性。其核心是電子轉(zhuǎn)移規(guī)律，主要類型有H轉(zhuǎn)移重排(游離基誘導(dǎo)的重排和電荷誘導(dǎo)的重排)、電荷中心誘導(dǎo)斷裂、簡單鍵斷裂(α、σ、β)[8]。

通過對喹諾酮類藥物的裂解機(jī)理進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)喹諾酮類藥物具有穩(wěn)定的母核喹諾酮萘啶環(huán)結(jié)構(gòu)，離子斷裂方式主要為中性丟失—H2O、—CO2、—HF、—CO、—CH2CH2，脫羧后均發(fā)生哌嗪環(huán)結(jié)構(gòu)的重排反應(yīng)。重排方式有兩種，碎片離子主要為脫羧產(chǎn)物與哌嗪環(huán)結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物。以恩諾沙星為例，其分子式為C19H22FN3O3，研究表明，恩諾沙星、麻保沙星、洛美沙星的斷裂特征一致，均生成C4H10N+(m/z72.080 78)碎片離子。對大環(huán)內(nèi)酯中紅霉素類藥物進(jìn)行研究，以泰樂菌素為例，其分子式為C46H77NO17，而實驗發(fā)現(xiàn)紅霉胺、紅霉素A、羅紅霉素和泰樂菌素等藥物均有C5H7O+(m/z83.049 14)碎片離子。因此，藥物效能與分子離子裂解特征一致，特征碎片離子可用于該類化合物的篩查。

表2列出了7類獸藥的特征碎裂片段。其中，①磺胺類獸藥的活性基團(tuán)為對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與氨苯甲酸結(jié)構(gòu)相似，因而可與氨苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，抑制二氫葉酸的合成，進(jìn)而影響細(xì)菌的嘧啶和嘌呤核苷酸的形成，阻礙細(xì)菌生長繁殖[9-11]。對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜碎片為C6H6NO2S+(m/z156.011 38)。②四環(huán)素類獸藥的功能基團(tuán)為并四苯基本骨架結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與細(xì)菌的核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，阻礙酰胺基轉(zhuǎn)運RNA到達(dá)A位，抑制核蛋白體與核糖結(jié)合[12]。并四苯基本骨架結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜碎片為C19H13O6+(m/z337.070 66)。③苯丙咪唑類獸藥的功能基團(tuán)為苯丙咪唑結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)通過選擇性阻礙真菌細(xì)胞色素依賴性的去甲基酶活性，使甲基固醇蓄積，抑制細(xì)胞膜麥角固醇合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性改變，真菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流失而死亡[13]。苯丙咪唑結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜碎片為C4H8N+(m/z70.065 13)。④大環(huán)內(nèi)酯類獸藥為糖衍生物與大環(huán)內(nèi)酯基團(tuán)以糖苷鍵相連而成的抗生素，大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)通過與細(xì)菌核糖體50S亞基23SrRNA結(jié)合，抑制信使RNA位移與轉(zhuǎn)肽作用，從而阻礙相應(yīng)的蛋白質(zhì)合成[14]。大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜碎片為C5H7O+(m/z83.049 14)。⑤喹諾酮類獸藥的功能基團(tuán)為氮(雜)雙并環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)通過抑制脫氧核糖核苷酸回旋酶活性，使雙股脫氧核糖核苷酸無法扭曲成為超螺旋結(jié)構(gòu)，阻止細(xì)菌細(xì)胞分裂[15]。氮(雜)雙并環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜碎片為C4H10N+(m/z72.080 78)[15]。⑥β-內(nèi)酰胺類獸藥的活性結(jié)構(gòu)為β-內(nèi)酰胺環(huán)，此結(jié)構(gòu)可與青霉素結(jié)合蛋白相結(jié)合，阻礙細(xì)菌的細(xì)胞壁粘肽合成酶活性，造成細(xì)胞壁缺損，使細(xì)菌最終膨脹裂解。β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜碎片為C5H10NO2+(m/z116.070 60)[16]。⑦氯霉素類獸藥的功能基團(tuán)為二氯乙酰胺結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可與細(xì)菌核糖核蛋白體的50S亞基結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)肽酰酶的作用，抑制50S亞基與胺基酰轉(zhuǎn)運RNA終端結(jié)合，從而阻礙形成新的肽鏈，導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法合成[17-18]。二氯乙酰胺結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜碎片為C4H4Cl2NO-(m/z151.967 54)。

表2 34種獸藥的特征碎裂片段Table 2 Characteristic fragmentations of 34 veterinary drugs

2.2.3 特征碎裂片段在獸藥篩查中的應(yīng)用將特征碎裂片段結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫信息應(yīng)用于未知獸藥殘留篩查。第一步，運用Full MS/vDIA掃描模式，采用表2中獸藥特征碎裂片段的精確質(zhì)量數(shù)提取色譜峰；第二步，分析捕集的呈高斯分布的色譜峰，并比對獸藥的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫信息，判斷該物質(zhì)的歸屬類別；第三步，通過分析片段的質(zhì)譜信息(m/z、同位素峰度比、片段峰度比)及斷裂途徑，推斷該物質(zhì)的元素組成；第四步，利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜、質(zhì)譜信息進(jìn)行確證和定量。

圖2 雙氟沙星的高分辨質(zhì)譜圖Fig.2 High resolution mass spectrum of difloxacin

例如，在篩查深加工羊肉制品中的獸藥殘留時，F(xiàn)ull MS/vDIA掃描模式下采用獸藥的特征斷裂片段從總離子流圖中提取呈高斯分布的質(zhì)譜信息，如圖2所示，該化合物的碎裂片段為氮(雜)雙并環(huán)結(jié)構(gòu)，初步判定該物質(zhì)為喹諾酮類藥物，分子式為CaHbNcOdFe。結(jié)合密度泛函理論對該片段的碎裂途徑進(jìn)行分析，將峰度較高的碎裂途徑與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)信息進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該化合物的碎裂途徑(圖3)與恩諾沙星相似，通過匹配標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息，最終確證其為雙氟沙星，分子式為C21H19N3O3F2，定量結(jié)果為1.5 μg/kg。

圖3 雙氟沙星的斷裂途徑Fig.3 Proposed fragmentation of difloxacin

2.3 篩查方法建立

篩查方法主要有兩步：篩選與確證，判定的基礎(chǔ)為7類獸藥的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫與其相應(yīng)的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本實驗主要按照以下步驟篩選：按照“1.2”方法對樣品進(jìn)行前處理與質(zhì)譜檢測，掃描方式為Full MS/vDIA；加載譜庫與特征碎裂片段；加載篩查方法；數(shù)據(jù)處理。當(dāng)應(yīng)用設(shè)定的保留時間與質(zhì)荷比質(zhì)量偏差提取窗口提取到響應(yīng)強度≥8.3×104的色譜峰時，初步判斷為陽性樣品，通過同位素離子峰信息與二級碎裂片段豐度比進(jìn)行確證；若未提取到色譜峰，初步判斷為陰性樣品，進(jìn)一步提取與分析特征斷裂片段，對未知目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行篩查分析，進(jìn)而得出結(jié)論。采用Exact Finder軟件分析全掃描及二級碎裂片段譜圖，提取目標(biāo)物信息。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

通過在空白羊肉基質(zhì)提取液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以基質(zhì)效應(yīng)(ME)=(1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%來評價目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)[19-20]。當(dāng)ME在±20%范圍內(nèi)，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱；當(dāng)ME的絕對值大于20%或小于50%時，表明存在中等強度的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME的絕對值大于50%且小于100%時，表明基質(zhì)效應(yīng)較強。結(jié)果顯示，34種化合物均存在一定程度的基質(zhì)效應(yīng)，在建立校準(zhǔn)曲線時，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行校正補償，以減小基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。

2.5 方法學(xué)考察

依據(jù)歐盟SANCO/12571/2015[21]與2002/657/EC[22]考察回收率、精密度、檢出限、定量下限與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。本實驗采用CCα與CCβ分別表示方法檢出限與定量下限。CCα的測定采用校準(zhǔn)曲線法，使用羊肉制品空白樣品，按照等距離梯度添加混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，根據(jù)添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度與峰面積繪圖，CCα則等于能觀察到響應(yīng)時縱坐標(biāo)軸上的濃度值與對應(yīng)重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的2.33倍之和。CCβ為CCα與CCα取值時重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的1.64倍之和。由表3可見，34種獸藥在對應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，檢出限和定量下限分別為0.04～4.76 μg/kg和0.07～8.24 μg/kg。在空白樣品中分別加入1倍、2倍和4倍CCβ 3個濃度水平的獸藥系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實驗，每個濃度水平重復(fù)6次。34種獸藥的平均回收率為79.4%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.30%～7.5%，表明此方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 34種獸藥的線性關(guān)系、CCα、CCβ、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Linear relations，CCα，CCβ,recoveries and relative standard deviations of 34 standards(n=6)

2.6 實際樣品測定

應(yīng)用建立的方法篩查市售36份深加工羊肉制品中的獸藥殘留，檢出2份陽性樣品，其提取離子流色譜圖見圖4。其中1份檢出磺胺二甲嘧啶(圖4A)，含量為2.2 μg/kg；另1份檢出標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫外的化合物雙氟沙星(圖4B)，含量為1.5 μg/kg。結(jié)果表明，本方法可滿足獸藥殘留的日常監(jiān)測需求。

3 結(jié) 論

本研究通過UHPLC-Q-Orbitrap MS，采用Full MS/dd-MS2與Full MS/vDIA兩種模式，總結(jié)了7類獸藥的結(jié)構(gòu)碎片與片段斷裂特征，建立了快速篩查深加工羊肉制品中未知獸藥殘留的非定向測定方法。方法學(xué)驗證表明，34種獸藥的檢出限和定量下限分別為0.04～4.76 μg/kg和0.07～8.24 μg/kg，平均回收率為79.4%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%～7.5%。本方法可滿足食品檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)對復(fù)雜基質(zhì)中未知獸藥殘留快速篩查和風(fēng)險評估的需求。