馬兜鈴酸致癌作用的分子毒理學(xué)關(guān)鍵點

馬 紅，黃 超，王方園，王亦男，劉淑清，楊 凌

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)系統(tǒng)藥物代謝動力學(xué)中心 上海 201203；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 大連 116044）

1 致癌物評價基于對其固有特性的評價

1.1 馬兜鈴酸為何被確定為致癌物？

1.1.1 致癌物定義

致癌物是指可誘發(fā)或增加癌癥發(fā)生率的化學(xué)物質(zhì)或化學(xué)混合物，這是化合物的固有特性，因此，只要能反映出其固有特性，并依據(jù)固有特性產(chǎn)生的評價方式都可以作為衡量手段。這里需要指出其中包括了兩個重要含義：①除非有明確的機(jī)理證據(jù)表明所引發(fā)的良惡性腫瘤在種屬間有明顯差異性重要事件或決定性事件，否則在動物中所發(fā)生致癌結(jié)果同樣會發(fā)生于人體，也即動物致癌物也被視為或假設(shè)為人體致癌物；②致癌物的定義中涉及的第2個含義是指致癌物性質(zhì)只取決于其物質(zhì)的內(nèi)在本性，不需要提供其在具體使用環(huán)節(jié)中致人體致癌風(fēng)險的劑量及其環(huán)境相關(guān)信息[1,2]。

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)，從1971年起組織專家組收集和評價世界各國有關(guān)化學(xué)物質(zhì)對人類致癌危險性的資料，編輯出版《IARC 關(guān)于化學(xué)物質(zhì)致人類癌癥危險性評價專題論文集》，并于1979 年、1982 年和1987 年3次組織專家組對上述專題論文集所評價的環(huán)境因子和類別、混合物及暴露環(huán)境對人類的致癌性進(jìn)行再評價，并出版報告。自1987 年專題論文集改名為《IARC 關(guān)于致人類癌癥危險性評價專題論文集》，并擴(kuò)展到物理因子、生物因子致人類癌癥危險性評價。IARC 關(guān)于化學(xué)物質(zhì)致人類癌癥危險性分類只與一種化學(xué)物致癌性證據(jù)的充分性（證據(jù)權(quán)重）有關(guān)，而并不涉及其致癌活性大小及其機(jī)制[3]。

1.1.2 致癌物評價標(biāo)準(zhǔn)

國際上根據(jù)以下10條證據(jù)性事件（主要是分子毒理學(xué)證據(jù)）來分類、歸屬與定義致癌物：①本身或被代謝激活后是否產(chǎn)生親電性；②是否產(chǎn)生基因毒；③是否改變基因修復(fù)或引發(fā)基因組不穩(wěn)定性；？④是否誘發(fā)表觀遺傳學(xué)改變；⑤是否導(dǎo)致氧化應(yīng)激作用；⑥是否誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)；⑦是否產(chǎn)生免疫抑制；⑧是否產(chǎn)生受體介導(dǎo)的調(diào)控效應(yīng)？⑨是否導(dǎo)致細(xì)胞永生化？⑩是否改變細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡或營養(yǎng)供給？綜上所述，致癌物評價標(biāo)準(zhǔn)關(guān)注的是致癌機(jī)制中最關(guān)鍵性、轉(zhuǎn)折性事件，羅列于此的標(biāo)準(zhǔn)性事件可以通過不同方法與模型來實現(xiàn)。這些標(biāo)準(zhǔn)決定了分子毒理學(xué)的評價程序、信息收集與框架匯總，也是現(xiàn)行“3R”毒理學(xué)評判準(zhǔn)則的依據(jù)。該標(biāo)準(zhǔn)中，需要把最基本或最重大的要素與事件從致癌過程與機(jī)制中模式化地提煉出來，模型中的關(guān)鍵要素，再綜合考慮到具體測定方法的靈敏性、精確性、穩(wěn)定性等，制訂相應(yīng)的評價方法與準(zhǔn)則。因此，具體的評價方法是否用體內(nèi)或體外方法，則完全取決于能否實施上述原則。

表1 致癌物的分子毒理學(xué)事件[2-4]

如表1所示，馬兜鈴酸作為致癌物的重要特征：①有明確致人體癌癥的流行病學(xué)證據(jù)；②有親電加合物形成的鐵證；③有明確的突變標(biāo)識特征（Mutational Signature）：“A:T→T:A顛換突變”。無論是加合物或是上述突變標(biāo)識特征均可在體內(nèi)外標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)。依據(jù)以上定義與分類原則，馬兜鈴酸被確認(rèn)為致癌物。它還會引起人類癌癥，所以被確認(rèn)為“一級致癌物”[2,3]。

1.1.3 致癌物評價標(biāo)準(zhǔn)與機(jī)理研究的區(qū)別

在上述致癌物評價準(zhǔn)則中，致癌過程和機(jī)制當(dāng)然非常關(guān)鍵，但與致癌物標(biāo)準(zhǔn)不同的是具體致癌機(jī)制與過程取決于具體的模型對象，與模型的種屬、個體、代謝能力、DNA修復(fù)過程等相關(guān)。研究對象不一定是標(biāo)準(zhǔn)化、模式化的，但可具有以上機(jī)制的代表性，這要根據(jù)機(jī)制研究強(qiáng)調(diào)的重點以及研究興趣點而決定的。

1.1.4 加合物產(chǎn)生機(jī)制[5]

人類經(jīng)常接觸的各種環(huán)境、飲食中基因毒物性物質(zhì)及內(nèi)源性的親電物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可以破壞DNA并形成共價修飾，即產(chǎn)生DNA加合物。在腫瘤相關(guān)基因的關(guān)鍵位點上形成的DNA 加合物被認(rèn)為是化學(xué)致癌作用的第一步。許多致癌物質(zhì)在與DNA 共價結(jié)合之前需經(jīng)代謝活化以形成反應(yīng)中間體。這些代謝活化反應(yīng)由體內(nèi)代謝酶（I 相和II 相代謝酶）催化產(chǎn)生。這些活性反應(yīng)中間體進(jìn)一步與DNA上的堿基、磷酸基團(tuán)或者脫氧核糖上的相關(guān)位點結(jié)合。而這種結(jié)合反應(yīng)包括多種類型，即反應(yīng)中間體可通過烷基化、雙親電子交聯(lián)以及通過與脂質(zhì)過氧化或自由基反應(yīng)形成DNA 加合物。DNA 加合物的類型取決于反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、親電性物質(zhì)的性質(zhì)以及反應(yīng)中間體與DNA嵌入的能力，決定加合物與哪些DNA堿基的上親核位點結(jié)合。加合物形成可發(fā)生在DNA的多個親核位點，包括鳥嘌呤和腺嘌呤的C8原子、核堿基的環(huán)上和環(huán)外N和O 原子及胞嘧啶C5-甲基的氧化。其中，胞嘧啶C5 甲基的氧化是表觀遺傳學(xué)的重要標(biāo)志。鳥嘌呤C8 原子氧化產(chǎn)生的7,8-二氫-8-氧鳥嘌呤(8-oxo-Gua)和2,6-二氨基-4-羥基-5-甲酰胺基(Fapy-Gua) 分別是氧化應(yīng)激和基因毒性病變標(biāo)志物。

1.1.5 堿基對替換突變特征與突變機(jī)制[6]

堿基替換是指基因組中堿基對被另一堿基對替換的現(xiàn)象。根據(jù)體細(xì)胞堿基置換方式，堿基對突變共有六種方式：C?G→A?T，C?G→G?C，C?G→T?A，T?A→A?T，T?A→C?G 以及T?A→G?C?？捎糜谙鄬Υ謺绶治鲆约澳[瘤類型或者外源性致癌物類型的分類[7]。馬兜鈴酸的主要堿基對替換特征是T?A→A?T 顛換[8]。此外，突變位置的側(cè)翼序列以及突變堿基對相鄰位置的堿基種類也影響突變率。堿基替換突變發(fā)生在DNA 損傷及修復(fù)或者DNA 復(fù)制的過程中。每種DNA損傷機(jī)制均有其相應(yīng)的堿基偏好，從而形成特征性的突變模式。每一種特定的突變特征實質(zhì)上都代表著不同的基因突變機(jī)理。因此，突變類型可以被視為致癌物的固有或內(nèi)在特征。

上述的突變特征說明的是致癌物的固有特征。在機(jī)理研究中，則要說明這些特征意味著什么？例如，內(nèi)源性DNA 損傷引起的突變模式與堿基的脫氨基反應(yīng)有關(guān)。常見的脫胺反應(yīng)包括5-甲基胞嘧啶→胸腺嘧啶、胞嘧啶→尿嘧啶、腺嘌呤→次黃嘌呤反應(yīng)。如甲基化CpGs是基因組中突變率最高的位點之一，同時也是C·G→T·A突變模式的主要影響因素。與這一現(xiàn)象相一致的是NpCpG位點的C·G→T·A突變是兩個最常見的突變模式1A 和1B的特征，其在至少25種不同的癌癥類型均有發(fā)現(xiàn)[7]。外源性的物理或化學(xué)因素也可導(dǎo)致DNA損傷，如非電離的紫外輻射能導(dǎo)致相鄰的嘧啶核苷酸的共價修飾。這種修飾形成了嘧啶二聚體：嘧啶光產(chǎn)物及環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）。與紫外線照射有關(guān)的皮膚癌（例如鱗狀細(xì)胞皮膚癌和惡性黑色素瘤）中也多見雙嘧啶堿基位點的C·G→T·A 突變或是CC·GG→TT·AA突變。

DNA修復(fù)過程中也能導(dǎo)致DNA損傷，如堿基切除修復(fù)（BER）中，當(dāng)DNA糖基化酶識別損傷位點后會水解裂解和移除改變的堿基，從而產(chǎn)生無尿或無嘧啶位點。未修復(fù)的無尿或無嘧啶位點在復(fù)制過程中很容易引入錯誤的堿基，從而引起突變。核苷酸切除修復(fù)（NER）是一種非特異性的修復(fù)過程，當(dāng)檢測到大量的DNA 畸變時，例如苯并芘（BaP）和黃曲霉毒素等芳香胺引起的大量加合物以及鉑類化合物、補(bǔ)骨脂素和UV誘導(dǎo)的損傷等，都會激活這種修復(fù)過程。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)是典型的DNA修復(fù)類型，這種修復(fù)機(jī)制將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄鏈上的DNA損傷修復(fù)效率比非轉(zhuǎn)錄鏈更高。因此，在某些突變模式中出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄鏈差異。復(fù)制后錯配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)可以識別和修復(fù)錯誤的堿基，以及在DNA復(fù)制和DNA重組修復(fù)活動中出現(xiàn)的錯誤。因此，MMR通路的缺陷增加了自發(fā)突變率，MMR相關(guān)蛋白的突變則影響基因組的穩(wěn)定性并導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA 不穩(wěn)定性增加。雖然NMR 相關(guān)的堿基突變特征目前還沒有確切研究，但是在原發(fā)性癌癥中發(fā)現(xiàn)NpCpG位點處的C·G→T·A以及CpCpC位點處的C·G→A·T均與MMR缺失相關(guān)。除此之外，MMR基因缺陷相關(guān)的癌癥中出現(xiàn)大量的1-bp 插入突變，這一突變引起微衛(wèi)星DNA 不穩(wěn)定性。由于人類基因組非常龐大，DNA合成過程中即使很低的錯誤率也會導(dǎo)致大量的突變，使得DNA復(fù)制錯誤也是突變產(chǎn)生的機(jī)制之一。高保真度B族DNA聚合酶Polδ和Pol ε由于具有校對功能，其每個堿基的合成錯誤率在1/107。體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中Polε的突變與結(jié)直腸癌和子宮內(nèi)膜癌有關(guān)的突變特征10相關(guān)，顯著表現(xiàn)為TpCpG 位點的C·G→A·T和C·G→T·A突變。另一導(dǎo)致復(fù)制過程中堿基錯配的因素是細(xì)胞中三磷酸脫氧核苷酸含量的失衡。在癌癥發(fā)展過程中，細(xì)胞周期調(diào)控失常導(dǎo)致對dNTP的需求增加。dNTP儲備的失衡可能導(dǎo)致插入-切除循環(huán)、堿基錯配以及校對效率，從而產(chǎn)生突變。

通過對9T 腫瘤中基因組序列的267192 個A-T 替換位點發(fā)現(xiàn)，突變腺嘌呤核苷酸位點兩側(cè)胞嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸（即突變位點為C|T]A）以及鳥嘌呤核苷酸（突變位點為AG）高表達(dá)。與此一致的是，在16種可能的A-T突變?nèi)塑账峤M合中，馬兜鈴酸引起的TAG和CAG最為常見。除了側(cè)翼序列（即+/-1）之外，位于+/-2位點的核苷酸也可能影響馬兜鈴酸的突變選擇性。例如C|TAG序列特征在其他非馬兜鈴酸引起的腫瘤中并未發(fā)現(xiàn)，說明其是馬兜鈴酸引起的突變的特異性特征。研究發(fā)現(xiàn)在馬兜鈴酸引起的A-T突變位點（TA 及CA）中5′端+2 位腺嘌呤核苷酸高表達(dá)（即ATA 及ACA）3′端-2 位以鳥嘌呤核苷酸常見（即AGG）。因此，馬兜鈴酸引起的A-T突變的主要序列特征為A[C|T]AGG，這一特征也在AA-UTUC外顯子中得以驗證[8]。目前認(rèn)為馬兜鈴酸引起的T?A→A?T 顛換與DNA復(fù)制過程相關(guān)，同時這一突變具有轉(zhuǎn)錄鏈偏差效應(yīng)，即轉(zhuǎn)錄鏈出現(xiàn)的突變率相較非轉(zhuǎn)錄鏈要低，這是由于DNA的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)機(jī)制，這種修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄鏈上的DNA損傷修復(fù)效率比非轉(zhuǎn)錄鏈更高[7,8]。

2 突變與致癌過程

腫瘤發(fā)生與發(fā)展基于遺傳信息突變的。在正常情況下，這些突變在組織中也會發(fā)生，并在組織間與物種間變化與傳遞。當(dāng)細(xì)胞分裂期間發(fā)生自發(fā)遺傳過程的錯誤時，其內(nèi)部許多修復(fù)機(jī)制與系統(tǒng)可以進(jìn)行校正，足以應(yīng)對這樣的突變頻率。只有當(dāng)損害持續(xù)并且到達(dá)產(chǎn)生腫瘤的閾值點才會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。從這個意義上講，人類的腫瘤或癌癥可視為一種遺傳性疾病。

2.1 致癌過程

腫瘤發(fā)生是多因素或多病因、多步驟、多年份、多基因和多途徑的，也即多特征的?；瘜W(xué)致癌作用步驟至少涉及三個重大步驟：“觸發(fā)”、“啟動”和“進(jìn)展”（圖1）。傳統(tǒng)上只用形態(tài)學(xué)特征來表征，但在觸發(fā)階段，分子毒理學(xué)水平的評價更為敏感和重要。

圖1 化學(xué)致癌作用過程的關(guān)鍵步驟

圖2 AAs-DNA加合物的結(jié)構(gòu)

顯然，馬兜鈴酸類化合物（AAs）進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)過活化產(chǎn)毒，生成相應(yīng)的活性中間體，與DNA 反應(yīng)形成加合物，DNA 加合物有多種結(jié)構(gòu)，代謝活化的AAs 與DNA 中嘌呤堿基的環(huán)外氨基形成AAs-DNA 加合物，如dA-AAI、dG-AAI、dA-AAII、dG-AAII（圖2）。DNA加合物聚集導(dǎo)致堿基突變，具體如AAI，先通過硝基還原反應(yīng)和環(huán)化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為N-羥基馬兜鈴酸（AL-NOHs）。然后形成具有非定域正電荷的親電性的環(huán)氮鎓離子中間態(tài)。中間態(tài)優(yōu)先結(jié)合DNA 中嘌呤堿基的環(huán)外氨基形成AAI-DNA 加合物，分別為dAAAI和dG-AAI，可促進(jìn)基因腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）的突變轉(zhuǎn)換，即AT→TA，如果受損傷的DNA未被完全修復(fù)或修復(fù)發(fā)生錯誤，會發(fā)生DNA 突變，DNA 突變?nèi)绻环糯蟮揭欢ㄋ?，使腫瘤抑基因TP53突變失去正常功能，從而使細(xì)胞增殖增強(qiáng)、分化異常，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。TP53突變和AAs代謝產(chǎn)物-DNA加合物的形成被認(rèn)為是一個階段性標(biāo)志，相應(yīng)的指標(biāo)也就成為評估AAs暴露及突變特征的生物標(biāo)志物。在上述過程中，醌氧化還原酶（NQOI）在肝和腎的AAs代謝活化中起著非常重要的作用，催化AAI 產(chǎn)生還原性環(huán)氮鎓離子[9]。環(huán)加氧酶（COX）也能催化AAI-DNA加合物的形成。馬兜鈴酸I（AAI）和馬兜鈴酸II（AAII）是主要毒性成分。以AAI 為例，AAs 致癌過程的關(guān)鍵步驟的差異主要涉及到生物轉(zhuǎn)化過程的參與。該生化過程包括AAI的活化、AAI-DNA加合物生成、DNA多位點突變。

2.2 肝臟代謝與轉(zhuǎn)運功能對AAs致癌作用的影響

2.2.1 總體暴露與一般規(guī)律

盡管近來有報道說AAs說可以造成人體肝癌[10,11]，但總體上，大量的流行病學(xué)證據(jù)表明，馬兜鈴酸的主要靶向組織器官被公認(rèn)為泌尿系統(tǒng)（表2）。馬兜鈴酸在體內(nèi)暴露并非均一，腎臟有明顯的富集作用[12]。經(jīng)口服途徑暴露后，腎臟中的檢出暴露量是肝臟以及其它組織的兩倍以上。

表2 暴露于馬兜鈴酸（AA）個體的腎組織中DNA加合物（dA-AAI）水平

如圖3 所示，代謝活化是主要化學(xué)誘變致癌的機(jī)制。在肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、腸細(xì)胞等的平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中富含細(xì)胞色素P450 單加氧酶系（Ⅰ相代謝酶系）。這些細(xì)胞色素P450單加氧酶將活性、極性基團(tuán)引入致癌物的結(jié)構(gòu)中，活化了致癌物，生成具有強(qiáng)親電性質(zhì)的物質(zhì)，從而引發(fā)DNA 加合物的形成。II 期反應(yīng)由肝內(nèi)和肝外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的UGT、SULT、COMT 等將強(qiáng)親水性基團(tuán)結(jié)合覆蓋于活化的官能基團(tuán)上，將降低毒性，增加水溶性，經(jīng)過體內(nèi)轉(zhuǎn)運體作用，再經(jīng)尿液、膽汁等排出體外。對于II 相酶活性較低的人群（如兒童、老年人，或者因疾病、遺傳、飲食或種族等因素所致II相酶活性降低）[13],致癌物的高暴露風(fēng)險將會增加（圖4）。

馬兜鈴酸的代謝表現(xiàn)出很大的個體差異，也就是并非所有暴露個體均會產(chǎn)生致癌作用。由于AAI 是AAs 中主要致癌物質(zhì)，比較傾向性的是AAI 代謝催化酶的高低是引發(fā)個體敏感性差異的原因之一。與上述一般機(jī)制一樣，主導(dǎo)AAs 毒性活化的催化代謝酶被認(rèn)為是NQOI 和COX[14]。比較有爭議的是肝臟CYP 還原酶（CRP）與P4501A（1A1與1A2）的催化作用。

圖3 AAs的生物活化和DNA加合物形成的途徑

圖4 基因毒和非基因毒性事件對致癌過程

2.2.2 AAs代謝作用的爭議

早期的體外研究認(rèn)為，AAI在經(jīng)肝臟CYP1A1/2去甲基化的過程是毒性激活過程，但近期體內(nèi)外研究已經(jīng)基本確立肝臟CYP1A1/2 去甲基化的過程是AAI 的解毒過程。如使用肝臟CYP 還原酶缺失（Hepatic cytochrome P450 (Cyp) Reductase Null，HRN）小鼠（其中，肝細(xì)胞中NADPH 依賴性Cyp 氧還酶被敲出）、Cyp1a1((-/-))、Cyp1a2((-/-))兩個單敲出小鼠、Cyp1a1/1a2((-/-))雙敲出小鼠[15]、以及人源性CYP1A導(dǎo)入小鼠，這些研究最終證實小鼠與人肝CYP1A（包括1A1 與1A2）是解毒作用，而CRP 仍然是毒性激活作用。另外，肝臟還有另一種毒方式，通過II相代謝將AAs磺酸化，再通過MRP 的協(xié)同外排作用，減小肝內(nèi)暴露。這些可以解釋為何肝臟開始接觸AAs量較腎臟如此之大卻能夠幸免于難。

2.2.3 轉(zhuǎn)運體的作用[16]

轉(zhuǎn)運體的影響不可小視，至少涉及到肝腎兩個臟器的轉(zhuǎn)運體。比較粗放的研究結(jié)論說，AAI 經(jīng)過磺酸化作用被MRP 排至血液、轉(zhuǎn)運至腎臟，由腎臟OAT 攝入而富集于腎臟與腎小管內(nèi)從而造成腎臟的高暴露。這里有兩個重要問題，被磺酸化后的AAI 結(jié)合物其DNA 結(jié)合作用到底是否減低？是磺酸化結(jié)合物分解后造成高暴露？兩個臟器都是富含轉(zhuǎn)運體的臟器，但這些轉(zhuǎn)運體，但還有哪些轉(zhuǎn)運體參與了這個轉(zhuǎn)運或者富集或者排泄過程？一般想定是轉(zhuǎn)運體間的微妙差異會決定兩者不同的暴露及最終命運？但這個作用到底有多么重要。這個方面的研究還相當(dāng)欠缺，其中沒有好的同時導(dǎo)入多轉(zhuǎn)運體的活體模型是一個關(guān)鍵或重要原因。

近期國內(nèi)許多研究團(tuán)隊證明在幼鼠中可以誘導(dǎo)出肝癌[10,11]，但在成年鼠中比較難以獲得致癌結(jié)局。作者斗膽猜測與幼鼠的CYP活性過低、磺酸化酶與轉(zhuǎn)運體等發(fā)育不全有關(guān)。當(dāng)然，作者建議，如再次進(jìn)行相關(guān)研究時，需要嚴(yán)密監(jiān)控相關(guān)代謝與轉(zhuǎn)運機(jī)制或有意設(shè)計相關(guān)模型來證實和排除作者的猜測。這個領(lǐng)域的研究對幫助我國學(xué)者樹立本學(xué)科的前沿與領(lǐng)先地位可能帶來機(jī)遇。

3 總結(jié)

馬兜鈴酸是一級致癌物，對于其評判分類與標(biāo)準(zhǔn)沒有爭議，主要學(xué)術(shù)爭論可能產(chǎn)生于外源性代謝與轉(zhuǎn)運在其致癌作用進(jìn)程及其致癌機(jī)制中的作用。此案評價是一個很好的范例，能夠幫助我們充分理解分子毒理學(xué)的國際研究規(guī)范，使我國相關(guān)的研究提升到一個新的水平。