小檗堿對代謝綜合征內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1-XBP1通路的影響

陶清華 陳小青 張 勇 莊永澤 王麗萍

研究發(fā)現(xiàn)代謝綜合征(MS)可引起腎損害,而腎損害又可進(jìn)一步加重MS[1]。越來越多證據(jù)支持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)與糖尿病腎病、肥胖相關(guān)性腎病、腎小球腎炎等多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療上述疾病已成為國內(nèi)外廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。我們前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可明顯降低代謝綜合征合并腎損害患者尿葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78) mRNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(CHOP)mRNA表達(dá)，并降低其血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白細(xì)胞介素8(IL-8)的含量，說明小檗堿可改善ERS，抑制機(jī)體微炎癥反應(yīng)及減少細(xì)胞凋亡而保護(hù)腎臟，但小檗堿是具體作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激某一通路還是作用于三條通路而減輕ERS尚不得知。因此我們進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小檗堿可抑制果糖誘導(dǎo)的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和真核啟始因子(eIF2α)的磷酸化，使GRP78、CHOP表達(dá)減少，從而調(diào)節(jié)PERK-eIF2α-CHOP通路減輕細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象，減少細(xì)胞凋亡率保護(hù)腎臟[4]。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步推測小檗堿也可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肌醇酶1(IRE1)-X盒結(jié)合蛋白1(XBP1)通路的過度激活，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來保護(hù)腎臟。故本文采用小檗堿對代謝綜合征合并腎損害患者尿IRE1、XBP1、半胱天冬酶12(caspase-12) mRNA及血、尿IRE1、XBP1、caspase-12蛋白表達(dá)情況的影響，從而探討其保護(hù)腎損害的分子生物學(xué)機(jī)制，為小檗堿在臨床的應(yīng)用提供依據(jù)。

對象和方法

研究對象選自2016年2月至2017年1月勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院腎內(nèi)科門診及住院臨床診斷符合代謝綜合征合并腎損害患者25例，采用隨機(jī)表方式隨機(jī)分成對照組、治療組，失訪5例，最后共納入20例，對照組10例，其中男6例，女4例，年齡(32.60±12.27)歲；治療組10例，其中男9例，女1例，年齡(38.30±9.96)歲。同時(shí)選取性別、年齡相匹配的健康者10例作為健康組。三組在年齡、性別上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且本研究已通過我院倫理委員會同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)(1)符合MS合并腎損害診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡18～60周歲； (3)尿微量白蛋白/肌酐比值范圍在30～200 mg/mmol；(4)血清肌酐(SCr)≤176.8 μmol/L； (5)腎損害病史出現(xiàn)在MS之后；(6)愿意在我院接受治療和隨訪并簽署知情同意書的患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)(1)小檗堿過敏者；(2)12個(gè)月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素的患者；(3)8周內(nèi)使用RAS阻斷劑者；(4)糖尿病急性并發(fā)癥；(5)Ⅰ型糖尿病、妊娠糖尿??；(6)腎病綜合征；(7)除外急性腎功能不全者；(8)妊娠或哺乳期婦女；(9)合并嚴(yán)重感染、嚴(yán)重心、腦、肝和造血系統(tǒng)疾病及精神病患者。

診斷標(biāo)準(zhǔn)代謝綜合征的診斷參照中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會(CDS) 2013標(biāo)準(zhǔn)[5]。 慢性腎臟病的診斷參照改善全球腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease:Improving Global Outcomes,KDIGO)2012標(biāo)準(zhǔn)[6]。

退出標(biāo)準(zhǔn)(1)治療期間出現(xiàn)過敏或發(fā)生不良事件，持續(xù)超過7d，無法繼續(xù)試驗(yàn)：①谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)>正常值上限2倍；②SCr>176.8 μmol/L；③白細(xì)胞<3.0×109/L，或中性粒細(xì)胞<1.5×109/L。(2)研究者認(rèn)為嚴(yán)重違背治療方案(患者不能遵循研究流程及用藥要求，依從性差未按規(guī)定用藥或擅自應(yīng)用降低小檗堿療效的含鞣質(zhì)的中藥)。(3)出現(xiàn)過敏反應(yīng)或嚴(yán)重不良事件者，根據(jù)醫(yī)生判斷應(yīng)該停止臨床試驗(yàn)者。(4)病程中病情惡化，根據(jù)醫(yī)生判斷應(yīng)該中止臨床試驗(yàn)者。(5)患者在臨床試驗(yàn)過程中不愿意繼續(xù)試驗(yàn)者。

治療方法對照組：基礎(chǔ)治療，即針對患者原有疾病的治療，如糖尿病、高脂血癥、高血壓、蛋白尿的治療。治療組：基礎(chǔ)治療+小檗堿，小檗堿劑量為0.3克，口服3次/d。兩組觀察時(shí)間均為8周。

實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本的采集及處理

尿液標(biāo)本的采集囑患者隨訪前一天20:00后禁食禁水，訪視當(dāng)天留取清潔中段晨尿15 ml，低溫離心后棄上清，取沉渣提取RNA。

血清標(biāo)本采集采集患者隨訪當(dāng)天的空腹靜脈血液標(biāo)本5 ml，低速離心分離出血清(常溫，3 000 r/min，5 min)，放入-80℃冰箱保存。

標(biāo)本檢測方法

尿液IRE1、XBP1、caspase-12mRNA測定采用RT-PCR法進(jìn)行操作：Trizol提取尿RNA，反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。IRE1引物序列為：上游5′-TCTGCCCATCAACCTCTCTT-3′，下游5′-CTGTCCACAGTCACCACCAG-3′，產(chǎn)物長度193 bp；XBP1引物序列為：上游5′-GGAGTTAAGACAGCGCTTGG-3′，下游5′-TCAATACCGCCAGAATCCAT-3′，產(chǎn)物長度191 bp；caspase-12引物序列為：上游5′-CTCAACATCCGCAACAAAGA-3′，下游5′-CACCAGGAATGTGCTGTCTG-3′，產(chǎn)物長度204 bp；GAPDH引物序列為:上游 5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′，產(chǎn)物長度200 bp。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)攝取所需各樣品電泳圖。通過Image J圖像分析軟件將各樣品電泳圖轉(zhuǎn)換為灰度值，基因的表達(dá)量由平均灰度值代替。平均灰度值=目的基因吸光度值(A)/β-actin吸光度值。

血清和尿液中IRE1、XBP1、caspase-12蛋白測定采用ELISA法進(jìn)行操作，所有操作均按試劑盒內(nèi)所附說明書進(jìn)行，最后用ELISA Calc回歸/擬合計(jì)算程序由說明書中標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與所測得的吸光度OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式，由方程式計(jì)算出樣品的濃度。

觀察指標(biāo)收集患者一般資料包括性別、年齡、體重、身高、腰圍、血壓、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。

收集患者治療前(T0)、治療后4周(T1)、治療后8周(T2)血、尿指標(biāo) 空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hPBG)、空腹胰島素(FINS)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿微量白蛋白/肌酐比值(U-mAlb/UCr)。

采用RT-PCR法檢測尿液中IRE1、XBP1、caspase-12mRNA的表達(dá)；采用ELISA法檢測血清及尿液中IRE1、XBP1、caspase-12蛋白的表達(dá)。

不良反應(yīng) 記錄患者治療前后的血常規(guī)、肝腎功能(總蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、膽紅素)、腎功能(尿素氮、SCr、尿酸)，及用藥期間是否出現(xiàn)消化道癥狀、皮疹等。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用《SPSS 20.0》軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)，組間比較采用組間方差分析，符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

基線資料兩組患者基線時(shí)腰圍、BMI、血壓、血脂、SCr、BUN、eGFR、U-mAlb/UCr及基礎(chǔ)治療情況均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

表1 對照組與治療組基線資料

BMI：體質(zhì)量指數(shù)；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；SCr:血清肌酐；BUN：尿素氮；eGFR:估算的腎小球?yàn)V過率；U-mAlb/UCr:尿微量白蛋白/肌酐比值；ACEI：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑；ARB：血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑;α-GI:α葡萄糖苷酶抑制劑

臨床觀察指標(biāo)的比較與治療前比較，治療組治療8周后BMI、收縮壓、舒張壓、FBG、2hPBG、FINS、TG、LDL-C、U-mALb/UCr均明顯下降(P<0.05)，對照組治療8周后SBP、DBP、U-mALb/UCr明顯下降(P<0.05)，兩組在BMI、FBG、2hPBG、FINS、TG、LDL-C比較上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。兩組治療前后在腰圍、HDL-C比較上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

表2 兩組治療前后臨床觀察指標(biāo)的比較

BMI:體質(zhì)量指數(shù)；FBG：空腹血糖；2hPBG:餐后2h血糖；FINS：空腹胰島素；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇；U-mALb/UCr：尿微量白蛋白/肌酐比值；#:與治療前相比，P<0.05;△:與對照組同時(shí)間點(diǎn)相比，P<0.05；T0:第0周;T2:第8周

實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化

血清XBP1、IRE1、caspase-12蛋白 與健康組比較，治療前兩組血清XBP1、IRE1、caspase-12蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，但兩組間無差異。治療8周后，兩組血清XBP1、IRE1、caspase-12蛋白表達(dá)均較治療前下降，對照組下降不明顯(P>0.05)，治療組下降明顯(P<0.05)，治療組療效優(yōu)于對照組(P<0.05)(表3)。

表3 各組患者治療前后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化

XBP1：X盒結(jié)合蛋白1；IRE1：肌醇酶1；caspase-12：半胱天冬酶12；T0:治療前，T2:治療后8周；*：與健康組比較，P<0.05；#：與治療前比較，P<0.05；△：與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05

尿液XBP1、IRE1、caspase-12蛋白 與健康組比較，治療前兩組尿XBP1、IRE1、caspase-12蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療8周后，兩組尿XBP1、IRE1、caspase-12蛋白表達(dá)均較治療前下降，對照組下降不明顯(P>0.05)，治療組下降明顯(P<0.05)，治療組療效優(yōu)于對照組(P<0.05)(表3)。

尿液XBP1、IRE1、caspase-12 mRNA 隨著治療時(shí)間的延長，治療組尿液XBP1、IRE1、caspase-12 mRNA的表達(dá)量逐漸減少，對照組其表達(dá)量無明顯改變(圖1)。

圖1 尿液XBP1、IRE1、caspase-12mRNA電泳圖

與健康組比較，治療前兩組尿液XBP1、IRE1、caspase-12mRNA灰度值均明顯升高(P<0.05)，兩組間無明顯差異。治療8周后，兩組尿液XBP1、IRE1、caspase-12mRNA灰度值較治療前下降，治療組下降明顯(P<0.05)，對照組下降不明顯(P>0.05)，治療組療效優(yōu)于對照組(P<0.05)(表3)。

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)的生理功能。當(dāng)細(xì)胞遇到營養(yǎng)缺乏、缺氧、代謝失衡、病毒感染、氧化應(yīng)激等因素時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工、修飾、運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)的功能發(fā)生紊亂，即形成ERS。大量研究表明，ERS反應(yīng)主要通過IRE1-XBP1、PERK-eIF2α、ATF6三條信號介導(dǎo)通路，其中IRE1信號介導(dǎo)通路在ERS反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用。XBPl是ERS反應(yīng)的關(guān)鍵信號調(diào)控因子，XBP1mRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)是IRE1活化所導(dǎo)致的特異性反應(yīng)，可提示腎臟損傷后存在IRE1介導(dǎo)通路的活化[7]。caspase-12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是ERS反應(yīng)誘導(dǎo)的三條細(xì)胞凋亡通路中重要的一條，ERS應(yīng)激時(shí)caspase-12表達(dá)上調(diào)，而且作為細(xì)胞凋亡的起始因子，在ERS反應(yīng)中也具有非常重要意義[8-10]。

研究發(fā)現(xiàn)小檗堿除具有降糖、降壓、降尿酸、降脂、改善胰島素抵抗，減輕體重等作用[11]，還具有腎臟保護(hù)作用。Wan等[12]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可改善腎臟的高膽固醇血癥和氧化還原狀態(tài)，抑制iNOS及TGF-β在腎臟表達(dá)水平，并減弱核因子κB(NF-κB) DNA活性、下調(diào)p65/p50和IKKβ蛋白水平，最終改善動脈粥樣硬化大鼠慢性腎損傷。亦有研究證明，小檗堿可通過調(diào)節(jié)ERS信號傳導(dǎo)通路保護(hù)腎小管近端上皮細(xì)胞損傷、降低足細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腎臟[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿治療8周后，治療組BMI、FBG、2hPBG，TG、LDL-C、FINS水平均低于對照組(P<0.05)，治療組尿IRE1、XBP1、caspase-12mRNA，血及尿IRE1、XBP1、caspase-12蛋白的表達(dá)均低于對照組(P<0.05)，說明小檗堿可改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，且抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1-XBP1通路的過度激活，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，但其作用機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，IRE1-XBP1信號通路能維持腸道黏膜屏障、維持腸道潘氏細(xì)胞數(shù)目、促進(jìn)腸道內(nèi)細(xì)胞因子分泌等方式保護(hù)腸道黏膜，減少腸道炎癥的發(fā)生[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿具有調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制有害菌生長，保護(hù)腸道潘氏細(xì)胞，減輕炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)毒素血癥的作用[16]。由此我們推斷小檗堿可能通過上述作用改善腸道菌群而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1-XBP1通路的過度激活，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，小檗堿可降低代謝綜合征合并腎損害患者尿IRE1、XBP1、caspase-12 mRNA，血及尿IRE1、XBP1、caspase-12蛋白的表達(dá)，并可改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂水平，其機(jī)制可能與小檗堿可抑制代謝綜合征合并腎損害患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1-XBP1通路的過度激活有關(guān)。本研究尚有如下不足之處：(1)本研究是單中心小樣本臨床研究，病例數(shù)較少，且入組標(biāo)準(zhǔn)為代謝綜合征合并腎損傷患者，病例有較大的異質(zhì)性，僅能作為觀察性研究結(jié)果，機(jī)制的分析還需要進(jìn)一步研究。(2)隨訪時(shí)間僅8周，未進(jìn)一步隨訪患者IRE1、XBP1、caspase-12水平的變化。(3)血清標(biāo)本留取較少，為避免反復(fù)凍融，未檢測患者的血清IRE1、XBP1、caspase-12 mRNA的表達(dá)。因此，尚需更大樣本、更長時(shí)間的多中心研究，并通過動物實(shí)驗(yàn)相互驗(yàn)證，從而得出更加科學(xué)的研究結(jié)論。