槲皮苷對免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用①

陳龍云 周艷艷 徐安莉 趙 敏 黃 敏 陳會敏

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430000)

槲皮苷(Quercitrin，QI)作為天然黃酮苷化合物具有廣泛的藥理活性，不僅在抗心腦血管疾病、神經(jīng)保護及調(diào)血脂等方面具有良好藥理活性[1]，而且還具有抗過敏、抗氧化、止咳平喘、抗血小板聚集、降血糖和抗腫瘤等作用[2]。槲皮苷在自然界分布廣泛且含量豐富，具有多種活性而又幾乎無毒副作用，是非常有潛力的天然先導(dǎo)化合物。然而國內(nèi)外關(guān)于槲皮苷針對免疫低下機體的免疫功能的影響相關(guān)研究較少。劉曉巖等[3]研究表明槲皮苷可能通過一氧化氮及免疫調(diào)節(jié)機制對睡眠剝奪大鼠的睡眠產(chǎn)生積極影響，同時也可對正常大鼠進行免疫調(diào)節(jié)。本實驗采用實驗性免疫抑制小鼠為模型，探討槲皮苷對免疫抑制小鼠免疫功能的影響并研究其作用機制，為其在增強免疫低下人群的免疫功能及治療相關(guān)疾病方面提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1材料 環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)購自上海源葉生物，雞紅細胞購自武漢純度生物，槲皮苷均購自美國Sigma公司;IgG、IgM、IL-2、IL-4、SOD、CAT等ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)；細胞ROS檢測試劑盒、BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；CD4-FITC、CD8-PE antimouse單抗購自BioLegend公司；蛋白Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；小鼠單抗β-actin、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗、兔多抗NF-κB p65、兔多抗TLR2均購自Affinity公司；6周齡BALB/c小鼠購自武漢大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK(鄂)2018-0003。

流式細胞儀(CytoFLEX，美國Beckman Coulter公司)；倒置顯微鏡(IX51，中國OLYMPUS公司)；低速離心機(5702R，德國Eppendorf公司)；酶標(biāo)儀(Multi skan MK3，美國Thermo Scientific 公司)；凝膠電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀 (BioSpectrum，美國UVP公司)。

1.2方法

1.2.1造模與給藥 50只BALB/c小鼠體重18～22 g，雌雄各半，隨機分為對照組、模型組(200 mg/kg)、槲皮苷低劑量組(20 mg/kg)、槲皮苷中劑量組(50 mg/kg)和槲皮苷高劑量組(80 mg/kg)(給藥劑量參考Li及劉珊珊等[4,5]的研究)，每組10只。于恒溫(22～26℃)、恒濕(42%～65%)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水。7 d后模型小鼠均一次性腹腔注射CTX 200 mg/kg，對照組注射等體積生理鹽水；槲皮苷低劑量組(20 mg/kg)、槲皮苷中劑量組(50 mg/kg)和槲皮苷高劑量組(80 mg/kg)均第2天開始灌胃給藥，對照組及模型組每天灌胃等體積生理鹽水。連續(xù)治療14 d。

1.2.2稱重法測定小鼠免疫器官指數(shù) 末次給藥24 h后處死小鼠，立即稱小鼠體重；無菌條件下迅速取出脾臟和胸腺器官洗凈并稱重，根據(jù)以下公式計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)%=[脾臟重量(g)/小鼠體重(g)]×100%；胸腺指數(shù)%=[胸腺重量(g)/小鼠體重(g)]×100%。

1.2.3Giemsa染色法檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能 小鼠末次給藥后腹腔注射0.5 ml生理鹽水(含1%雞紅細胞)，輕揉小鼠腹部使雞紅細胞分散。1 h后處死小鼠，暴露腹膜并注入200 μl PBS，反復(fù)混勻后吸取腹腔液均勻涂片，置于濕盒中37℃孵育，30 min后用生理鹽水洗去未吸附雞紅細胞，丙酮-甲醇溶液固定5 min，Giemsa液染色15 min后鏡檢，每片計數(shù)200個巨噬細胞，按照以下公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬百分率%=(吞噬雞血紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù))×100%；吞噬指數(shù)%=(被吞噬的雞血紅細胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù))×100%。

1.2.4ELISA測定小鼠血漿IgG、IgM、IL-2及IL-4水平 各實驗組眼眶取血，低溫高速離心取血漿。根據(jù)相應(yīng)ELISA試劑盒說明書進行小鼠血漿IgG、IgM、IL-2及 IL-4含量的測定。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細胞亞群 頸脫臼處死小鼠，無菌條件下取脾臟，經(jīng)過研磨并過濾制成單細胞懸液，RPMI1640洗滌，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 min，棄上清，加2 ml紅細胞裂解液，室溫靜置3 min使紅細胞完全裂解，然后再以3 000 r/min離心1 min，棄上清，以RPMIl640培養(yǎng)基洗滌并重復(fù)離心1次，得細胞沉淀制作小鼠脾細胞混懸液(1×107個/ml)，各流式檢測管中分別加入100 μl，再分別加入FITC-CD4、PE-CD8抗體各2 μl，振蕩混勻后4℃避光靜置30 min；PBS洗滌，離心2次，棄上清，再加入PBS重懸細胞后上機檢測，F(xiàn)low Jo軟件分析。

1.2.6小鼠免疫器官組織學(xué)觀察 脫頸椎處死小鼠，無菌取出胸腺、脾臟，以波恩固定液固定。組織依次用75%、85%、90%、95%及無水乙醇進行組織脫水，以二甲苯進行透明處理，后以60℃石蠟缸進行浸蠟，再進行石蠟包埋并切片，然后脫蠟，蘇木素-伊紅染色，1%的鹽酸酒精分化，中性樹膠封片，最后光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟細胞ROS水平 小鼠脾細胞懸液(1×107ml-1)各取100 μl加入到流式檢測管，按照DCFH-DA細胞ROS檢測試劑盒說明操作。上機檢測后以Flow Jo軟件分析。

1.2.8ELISA測定小鼠血漿SOD、MDA及CAT的水平 各實驗組隨機取8只小鼠，末次給藥24 h后，眼眶取血，低溫高速離心取血漿。小鼠血漿中SOD、MDA及CAT的含量檢測以相應(yīng)ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.9Western blot法檢測NF-κB p65、TLR2蛋白表達情況 取剪碎的脾臟組織于自動勻漿機中充分勻漿，加入600 μl組織蛋白裂解液冰上裂解 15 min，4℃下以14 000 r/min轉(zhuǎn)速離心 10 min，收集上層清液。BCA法測定相應(yīng)蛋白濃度。取等量樣品以12% SDS-PAGE電泳分離，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉緩沖液室溫封閉2 h，經(jīng)兔多抗NF-κB p65(1∶2 000)、兔多抗TLR2(1∶1 000)、內(nèi)參β-actin(1∶1 000)等一抗4℃搖床孵育過夜，充分洗滌后，再以相應(yīng)辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗37℃搖床孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。以美國 UVP 分析儀器掃描膠片，再以Quantity One 軟件分析各蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1小鼠免疫器官指數(shù)測定結(jié)果 如圖1，較對照組而言，模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著降低(P<0.000 1)；與模型組相比，低劑量槲皮苷組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中劑量組和高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著上升(P<0.05)，且高劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)大于中劑量組。

2.2小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測結(jié)果 Giemsa染色結(jié)果顯示(圖2A)，巨噬細胞吞噬雞紅細胞程度不同：未被吞噬的雞紅細胞呈粉紅色，散在分布，也有部分聚集在巨噬細胞周圍，而吞噬細胞則呈球形，著藍色；已吞入雞紅細胞的巨噬細胞整體形狀不規(guī)則，著色加深；有的巨噬細胞吞入了多個紅細胞，體積變大且著色更深，為紫黑色。統(tǒng)計結(jié)果顯示(圖2B、C)，模型組吞噬百分率和吞噬指數(shù)均極顯著低于對照組(P<0.000 1)；與模型組相比，低劑量槲皮苷組小鼠的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均上升，其中吞噬百分率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而吞噬指數(shù)統(tǒng)計有差異性(P<0.05)；中劑量組及高劑量組小鼠的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著上升(P<0.01)，且高劑量組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均大于中劑量組。

2.3小鼠血漿免疫球蛋白及細胞因子水平測定結(jié)果 根據(jù)圖3A、B，與對照組相比，模型組的IL-2、IL-4水平明顯下降(P<0.000 1)；與模型組相比，給予不同劑量槲皮苷干預(yù)組小鼠的IL-2、IL-4水平均發(fā)生明顯上升(P<0.05)，且高劑量組的IL-2、IL-4水平均高于中劑量組。同時，模型組IgG、IgM含量較之于對照組顯著下降(P<0.000 1)；與模型組相比，低劑量槲皮苷組的IgG含量均上升但差異未有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，IgM的含量統(tǒng)計差異性顯著上升(P<0.000 1)；中劑量組和高劑量組的IgG、IgM含量均顯著上升(P<0.01)，且高劑量組的IgG、IgM含量均大于中劑量組(圖3C、D)。

圖1 小鼠免疫器官指數(shù)測定Fig.1 Determination of immune organ indices of miceNote: ###.P<0.000 1 vs control group;*.P<0.05，***.P<0.000 1 vs model group.Control.Control group；CTX Model.Model group which was dealt with cyclophosphamide (200 mg/ml)；CTX+QIL.Group which was dealt with both cyclophosphamide and low dose of quercitrin (20 mg/ml)；CTX+QIM.Group which was dealt with both cyclophosphamide and medium dose of quercitrin (50 mg/ml)；CTX+QIH.Group which was dealt with both cyclophosphamide and high dose of quercitrin (80 mg/ml),similarly hereinafter.

圖2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測

Fig.2 Detection of phagocytic function of mouse perito-neal macrophages

Note: A.Result of giemsa staining (×400)；B.Statistical graph of phagocytosis percentage；C.Statistical graph of phagocytosis index.###.P<0.000 1 vs control group;*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.000 1 vs model group.

圖3 ELISA檢測小鼠血漿IgG、IgM及IL-2、IL-4細胞因子含量Fig.3 Detection of plasma IgG,IgM,IL-2,IL-4 cytokines in mice by ELISANote: A.IL-2;B.IL-4;C.IgG;D.IgM.###.P<0.000 1 vs control group;*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.000 1 vs model group.

2.4小鼠免疫器官組織的影響 觀察并分析HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組的小鼠脾臟結(jié)構(gòu)清晰，脾小體較大，中央動脈周圍淋巴細胞較為密集；模型組小鼠脾臟組織白、紅髓分界不清晰，脾小結(jié)數(shù)量減少；給予槲皮苷干預(yù)的各組脾臟白、紅髓分界隨劑量增大逐漸變清晰，脾小體數(shù)量逐漸增多，體積較模型組大；淋巴細胞數(shù)量也隨著槲皮苷劑量的增加較模型組增多(圖4)。

圖4 小鼠免疫器官組織學(xué)觀察Fig.4 Histological observation of mouse immune organsNote: The dark blue round or oval body are white pulp;the purple parts are mainly red pulp.

2.5小鼠脾淋巴細胞亞群檢測結(jié)果 由圖5可知，模型組的CD4+、CD8+脾淋巴細胞水平和CD4+/CD8+值均顯著低于對照組(P<0.000 1)；與模型組相比，低劑量槲皮苷干預(yù)下小鼠CD4+脾淋巴細胞水平及CD4+/CD8+值均顯著高于模型組(P<0.05)，CD8+脾淋巴細胞水平較之模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中劑量組和高劑量組的CD4+、CD8水平以及CD4+/CD8+值均顯著上升(P<0.000 1)。

2.6小鼠脾臟細胞ROS水平的影響 DCF的熒光強度代表了細胞內(nèi)ROS水平的高低。根據(jù)流式結(jié)果，模型組脾臟細胞ROS水平顯著高于對照組(P<0.000 1)；給予不同劑量槲皮苷干預(yù)的各組均較模型組ROS水平升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)，見圖6。

2.7小鼠血漿中SOD、MDA及CAT水平的檢測 與對照組相比，模型組的SOD和CAT水平明顯降低(P<0.000 1)，而MDA水平則顯著升高(P<0.000 1)；相較于模型組，槲皮苷低劑量組的SOD和CAT水平升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.000 1)；槲皮苷中劑量組和高劑量組的SOD和CAT水平均顯著升高，且MDA水平顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見圖7。

圖5 流式檢測小鼠脾CD4+、CD8+淋巴細胞亞群含量Fig.5 Flow cytometry detection of CD4+,CD8+ lympho-cyte subsets in mouse spleenNote: A.Result of flow cytometry;B.Statistical result of CD4+;C.Statistical result of CD8+;D.Statistical result of CD4+/CD8+.###.P<0.000 1 vs control group;*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.000 1 vs model group.

圖6 流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟細胞ROS水平Fig.6 Flow cytometry detection of ROS levels in mouse spleen cellsNote: A.Flow cytometry.B.Respective statistical result.###.P<0.000 1 vs control group;***.P<0.000 1 vs model group.

圖7 小鼠血漿中SOD、MDA及CAT水平檢測結(jié)果Fig.7 Results of SOD,MDA and CAT levels in mouseplasmaNote: A-C.Statistical results of SOD,MDA and CAT level,respectively.###.P<0.000 1 vs control group;**.P<0.01,***.P<0.000 1 vs model group.

圖8 WB檢測脾臟NF-κB p65、TLR2蛋白表達水平變化Fig.8 WB determination of NF-κB p65 and TLR2 prote-in expression levels in spleenNote: A.Band of NF-κB p65 and TLR2 protein,respectively;B and C.Statistical graphs showing NF-κB p65 and TLR2 protein levels,respectively.###.P<0.000 1 vs control group；*.P<0.05，**.P<0.01,***.P<0.000 1 vs model group.

2.8WB檢測結(jié)果 如圖8，模型組中WB所檢測NF-κB p65及 TLR2蛋白的表達水平較之對照組均顯著升高(P<0.000 1)；槲皮苷各劑量組的NF-κB p65及 TLR2蛋白水平均發(fā)生顯著下降(P<0.000 1)，且隨著劑量增加，NF-κB p65及 TLR2蛋白水平下降越明顯。

3 討論

免疫力低下是導(dǎo)致疾病發(fā)生的關(guān)鍵原因之一。脾臟是機體最大的免疫器官，是機體的細胞免疫和體液免疫中心，既可通過吞噬作用發(fā)揮非特異性免疫功能，又可通過T、B細胞介導(dǎo)的細胞免疫和體液免疫發(fā)揮特異性免疫功能[6]。而胸腺作為機體免疫體系的主要內(nèi)分泌腺體，可通過分泌T細胞及胸腺素來參與機體細胞免疫過程，使機體保持免疫穩(wěn)態(tài)。胸腺可調(diào)控T細胞的分化成熟，使其表達不同的抗原，根據(jù)產(chǎn)生的免疫表型的不同分為CD4+、CD8+亞群，CD4+、CD8+T細胞可雙向調(diào)控免疫應(yīng)答，二者的比例失調(diào)會導(dǎo)致免疫功能失常。CD4+T細胞又可在外源抗原的刺激誘導(dǎo)下分化為Th1和Th2兩類細胞，Th1細胞可分泌IFN-γ和IL-2，介導(dǎo)細胞應(yīng)答；而Th2則主要產(chǎn)生IL-4、IL-6等細胞因子來介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，其含量及功能變化決定機體免疫功能[7-9]。另外，IgG、IgM水平也是反映體液免疫能力的常用指標(biāo)之一[10]。本研究通過CTX引起小鼠胸腺及脾免疫器官指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+值、IgG、IgM、IL-2及IL-4水平顯著下降，表明小鼠免疫抑制模型成功。分別給予50 mg/ml和 80 mg/ml槲皮苷干預(yù)均可顯著上調(diào)免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+值、IgG、IgM、IL-2及IL-4水平，20 mg/ml槲皮苷干預(yù)下免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+值、IgG、IgM、IL-2及IL-4水平等指標(biāo)也均得到上調(diào)，但部分指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；脾臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果也顯示脾臟紅、白髓的分界隨著槲皮苷干預(yù)劑量的增加逐漸清晰，高倍鏡下觀察到淋巴細胞也逐漸增多；以上均表明槲皮苷可呈劑量依賴性促進損傷脾臟組織的修復(fù)，并有助于淋巴細胞的增殖，調(diào)節(jié)淋巴細胞分泌細胞因子水平，促進吞噬功能恢復(fù)，增強免疫抑制小鼠的免疫器官功能，最終增強免疫低下小鼠的免疫功能。綜上所述，槲皮苷可從器官、細胞及分子層面上上調(diào)機體的細胞免疫與體液免疫水平，其作用具有劑量依賴性。

研究表明，氧化應(yīng)激可引起DNA損傷、蛋白變性或脂質(zhì)過氧化，表現(xiàn)為線粒體等損傷，最終使細胞被氧化損傷無法恢復(fù)，誘發(fā)機體患病[11]。王斌等[12]研究表明，高脂膳食誘導(dǎo)大鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，大鼠的體液免疫應(yīng)答水平明顯下降，且Billertakahashi等[13]也證實ROS含量過高可能導(dǎo)致機體免疫功能受抑，表明免疫功能的強弱與機體的抗氧化水平有關(guān)。因此，本實驗進一步探究槲皮苷對免疫抑制小鼠抗氧化水平的影響。結(jié)果槲皮苷可以劑量依賴方式下調(diào)模型組ROS、MDA水平同時上調(diào)SOD、CAT水平，提高機體抗氧化水平；這與Jiang等[14]研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷具有直接清除活性氧能力的結(jié)果相吻合。

NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，家族成員包括p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、RelA(p65)、RelB和cRel，參與調(diào)控氧化應(yīng)激過程。正常細胞中NF-κB p50/p65二聚體與它的抑制蛋白(IκB)結(jié)合而處于三聚體狀態(tài)，存在于胞漿。受外界刺激后，IκB發(fā)生磷酸化、泛素化并被降解，三聚體因此解離，NF-κB p50/p65轉(zhuǎn)入細胞核并與DNA的靶向序列相結(jié)合，從而啟動轉(zhuǎn)錄，在免疫、炎癥、氧化及細胞凋亡等方面起重要作用[15，16]。NF-κB是TLR2信號通路的下游靶標(biāo)蛋白，有研究證實來自生殖支原體的三?；鞍卓梢酝ㄟ^TLR1和TLR2激活NF-κB的表達[17]。本研究中槲皮苷以劑量依賴方式顯著下調(diào)小鼠脾臟組織NF-κB p65和TLR2蛋白的表達水平(P<0.05)，表明槲皮苷可能通過抑制NF-κB p65和TLR2蛋白的表達來改善小鼠免疫功能低下狀態(tài)。具體作用機制可能是通過抑制NF-κB p65和TRL2蛋白的表達，降低ROS水平并提高SOD水平和機體抗氧化水平，從而促進免疫器官功能恢復(fù)來提高免疫功能低下小鼠的免疫水平。

綜上，槲皮苷能促進免疫低下機體恢復(fù)免疫功能，并呈劑量依賴性。其可能的機制是抑制NF-κB p65和TRL2等蛋白表達，調(diào)節(jié)機體免疫相關(guān)細胞因子及抗氧化物質(zhì)，提高機體抗氧化水平，增強免疫器官水平，最終起到增強免疫低下小鼠免疫力的作用。