β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物對人絨毛膜細胞株JEG-3表達黏附分子及趨化因子的影響①

王 韌 周 紅 王 婷 李 娜 何 超 王 婷 張貴婷 陳芋丹 張 鵬

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013)

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome,APS)是以抗磷脂抗體(antiphospholipid antibodies,aPLs)的持續(xù)存在為主要特征的自身免疫性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為動靜脈血栓形成和流產(chǎn)，后者亦稱為自身免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[1,2]。形成自身免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)原因尚無定論，抗磷脂抗體[尤其是抗β2GPI 抗體(anti β2-glycoprotein I antibodies)]在其中的作用備受關(guān)注。β2GPI(β2-glycoprotein I)作為抗磷脂抗體的主要靶抗原，是一種被廣泛研究和識別的糖蛋白[3,4]。人胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞可以自身合成β2GPI，并且在漿膜上表達，進而將胎盤轉(zhuǎn)變?yōu)榭功?GPI抗體的主要靶標[5]。

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)抗磷脂抗體能夠改變?nèi)颂ケP絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的增生增殖，抑制細胞分化及絨毛膜促性腺激素的分泌，并且降低人胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的侵襲能力[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，抗磷脂抗體誘導(dǎo)補體系統(tǒng)的活化，導(dǎo)致炎癥發(fā)生和組織損傷[7]。因此普遍認為，相比較在母胎界面的血栓形成，抗磷脂抗體引起的自身免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)主要源自炎癥反應(yīng)發(fā)生和胎盤機能不全[8]。本課題組前期研究表明β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物能夠在體內(nèi)外促進高凝狀態(tài)及血栓形成，并加速動脈粥樣硬化形成[9]，但是對自身免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的作用并未涉及。本文在前期實驗和相關(guān)文獻報道的基礎(chǔ)上，重點探討β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物對人絨毛膜細胞株JEG-3表達黏附分子及趨化因子的影響，以及TLR4-MyD88信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人絨毛膜細胞株JEG-3(上海中國科學(xué)院細胞研究所)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal-bovine serum，Wisent)、胰酶(Gibco公司)；TLR4抑制劑TAK-242 (InvivoGen公司)；TRIzol試劑(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量試劑盒(Vazyme公司)；引物設(shè)計采用 Primer Premier 6.0軟件，由上海生工生物工程股份有限公司合成；兔抗人VCAM-1單克隆抗體、兔抗人ICAM-1單克隆抗體(Abcam公司)；兔抗人TLR4單克隆抗體、兔抗人MyD88單克隆抗體(Santa Cruz公司)；兔抗人GAPDH多克隆抗體(Bioworld公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體(康為世紀公司)；ECL 顯色試劑 (GE Healthcare公司)；IL-8 ELISA檢測試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)；非特異型對照抗體兔IgG(RIgG)(武漢博士德生物工程有限公司)；牛血清白蛋白(BSA)(愛必信公司)；人β2GPI和兔抗人β2GPI多克隆抗體由本實驗室制備[10,11]；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1JEG-3的培養(yǎng) JEG-3培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液(添加100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。取3～6代處于對數(shù)生長期的JEG-3接種于6孔板(5×105細胞/孔)或12孔板(2×105細胞/孔)或24孔板(1×105細胞)內(nèi)。37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，無菌PBS清洗2遍，換無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)6～18 h。參考文獻報道和課題組前期試驗，分別加入抗β2GPI抗體(100 μg/ml)、β2GPI(100 μg/ml)/抗β2GPI 抗體(100 μg/ml)復(fù)合物、對照抗體RIgG (100 μg/ml)、無血清培養(yǎng)基、β2GPI(100 μg/ml)、BSA(100 μg/ml)刺激[1]。對于抑制劑組，利用TLR4阻斷劑TAK-242 (5 μmol/L)預(yù)處理細胞6 h，無菌PBS清洗2次后再加入不同刺激物。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 以上刺激物作用于JEG-3 6 h后，去除含刺激物的培養(yǎng)液，PBS清洗2遍后按照試劑說明書提取細胞總RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄。按下述10 μl體系進行RT-qPCR反應(yīng)：SYBR?Green Master Mix 5 μl，上下游引物各0.2 μl，cDNA模板1 μl，RNase free H2O 3.6 μl。引物序列，產(chǎn)物長度及退火溫度見表1。反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，退火30 s ，72℃延伸20 s，40個循環(huán)擴增。反應(yīng)結(jié)果根據(jù)得到的Ct值經(jīng)內(nèi)參基因β-actin校正，以2-ΔΔCT法進行統(tǒng)計分析。

1.2.3Western blot分析 各種刺激物作用JEG-324 h后，去除含刺激物的培養(yǎng)液，PBS清洗2次，然后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，于冰上裂解1 h，期間每隔 15 min劇烈振蕩1次。經(jīng)4℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清測定蛋白濃度。取總蛋白100 μg與上樣緩沖液以體積比4∶1混合，100℃水浴10 min使蛋白變性，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，350 mA 恒流100 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h后置于TBS稀釋的VCAM-1(1∶2 000)、ICAM-1 (1∶2 000)、TLR4(1∶2 000)、MyD88(1∶2 000)、GAPDH (1∶2 000) 抗體中，4℃孵育過夜。次日TBS/T洗膜3次，每次15 min。采用TBS/T稀釋的HRP標記山羊抗兔IgG抗體(1∶3 000)室溫孵育1 h。TBS/T洗膜3次后，ECL顯色系統(tǒng)曝光顯影定影，觀察雜交條帶。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

Tab.1 Real-time PCR primer sequence

GenePrimer sequence(5′-3′)Amplified fragmentlength(bp)Annealingtemperature(℃) VCAM-1F:TTTGACAGGCTGGAGATAGACT17356R:TCAATGTGTAATTTAGCTCGGCAICAM-1F:AGCTTCGTGTCCTGTATGGC6956R:TTTCTGGCCACGTCCAGTTTIL-8F:ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC11255R:AACCCTCTGCACCCAGTTTTCTLR4F:CACCTGATGCTTCTTGCT23260R:TCACCTTTCGGCTTTTATMyD88F:GGCTGCTCTCAACATGCGA6156R:CTGTGTCCGCACGTTCAAGAβ-actinF:CCTGGCACCCAGCACAAT14056R:CATACTCCTGCTTGCTGATC

1.2.4ELISA檢測IL-8的蛋白水平 以前述各組刺激細胞培養(yǎng)24 h或48 h后，吸取上清，按ELISA操作流程處理。酶標儀讀取450 nm處吸光度(A)值，依據(jù)標準曲線計算IL-8的含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，對單因素處理組數(shù)據(jù)和雙因素處理組數(shù)據(jù)的比較分別使用One-way ANOVA法和Two-way ANOVA法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物促進JEG-3表達VCAM-1、ICAM-1、IL-8 利用RT-qPCR和Western blot以及ELISA分別在mRNA和蛋白層面檢測經(jīng)不同刺激物處理后JEG-3細胞的VCAM-1、ICAM-1、IL-8的mRNA 和蛋白表達變化。由圖1可見，β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物組相對于無任何刺激的Media組VCAM-1、ICAM-1的蛋白和mRNA的表達水平均顯著升高(P<0.001，圖1B；P<0.01，圖1C)。單獨的抗β2GPI抗體相對于Media組VCAM-1、ICAM-1蛋白表達水平也有升高，但沒有β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物組作用明顯。 圖2顯示β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物組相對于Media組IL-8 的蛋白及mRNA表達水平顯著升高(P<0.001)，兔源的無關(guān)抗體RIgG組和抗β2GPI抗體組相對于Media組mRNA的表達水平也有所升高，但表達水平次于復(fù)合物組。

2.2β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物促進JEG-3表達TLR4 和MyD88 JEG-3細胞經(jīng)不同刺激物處理后，RT-qPCR和Western blot檢測TLR4和MyD88的mRNA 和蛋白表達變化，結(jié)果如圖3所示。與Media組相比，單獨的抗β2GPI抗體組及β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物組TLR4、MyD88的蛋白及mRNA的表達水平均顯著升高(P<0.001，圖3B；P<0.01，圖3C)。而RIgG組相對于Media組TLR4、MyD88的蛋白及mRNA的表達水平則沒有表現(xiàn)出明顯差異。

2.3TLR4抑制劑抑制β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物誘導(dǎo)的JEG-3黏附分子VCAM-1、趨化因子IL-8 mRNA和蛋白的表達 通過RT-qPCR和Western blot以及ELISA分別檢測TAK-242 (5 μmol/L)預(yù)處理對Media、β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物和RIgG 誘導(dǎo)的JEG-3細胞VCAM-1、IL-8 mRNA和蛋白表達的影響。從圖4可以看出，TAK-242能夠部分抑制β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物刺激的JEG-3細胞VCAM-1的蛋白和mRNA高表達(P<0.001，圖4B)，但對RIgG刺激組則沒有表現(xiàn)出部分抑制作用。從圖5可以看出，TAK242能夠部分抑制β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物刺激的JEG-3IL-8的蛋白和mRNA高表達(P<0.01，圖5A；P<0.001，圖5B)，但同樣對RIgG刺激組沒有顯示出部分抑制作用。

圖1 不同刺激對JEG-3 VCAM-1、ICAM-1蛋白(A)和 mRNA(B、C)表達水平的影響Fig.1 Effects of different stimuli on expression levels of JEG-3 VCAM-1,ICAM-1 protein (A) and mRNA (B,C)Note: 1.Anti-β2GPI antibody;2.β2GPI/anti-β2GPI antibody;3.RIgG;4.Media;5.β2GPI;6.BSA.**.P<0.01，***.P<0.001 versus media.

圖2 不同刺激對JEG-3 IL-8蛋白(A)和 mRNA(B)表達水平的影響Fig.2 Effects of different stimuli on expression levels of JEG-3 IL-8 protein (A) and mRNA (B)Note: 1.Anti-β2GPI antibody;2.β2GPI/anti-β2GPI antibody;3.RIgG;4.Media;5.β2GPI;6.BSA .***.P<0.001 versus media.

圖3 不同刺激對JEG-3 TLR4、MyD88蛋白(A)和 mRNA(B、C)表達水平的影響Fig.3 Effects of different stimuli on expression levels of JEG-3 TLR4,MyD88 protein (A) and mRNA (B,C)Note: 1.Anti-β2GPI antibody;2.β2GPI/anti-β2GPI antibody;3.RIgG;4.Media;5.β2GPI;6.BSA .**.P<0.01,***.P<0.001 versus media.

圖4 TLR4在β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物促進JEG-3 VCAM-1蛋白和mRNA表達中的作用Fig.4 Role of TLR4 in promoting expression of JEG-3 VCAM-1 protein and mRNA in β2GPI/anti-β2GPI antibody complexNote: ***.P<0.001 versus noinhibitors.

圖5 TLR4在β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物促進JEG-3 IL-8蛋白和mRNA表達中的作用Fig.5 Role of TLR4 in promoting expression of JEG-3 IL-8 protein and mRNA in β2GPI/anti-β2GPI antibody complexNote: **.P<0.01,***.P<0.001 versus noinhibitors.

3 討論

血栓形成和習(xí)慣性流產(chǎn)是APS的顯著臨床特征，抗磷脂抗體(aPLs)是APS的診斷標志物和致病因素[12,13]，作為aPLs的主要致病抗體，抗β2GPI抗體的作用受到越來越多關(guān)注[14]，而β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物在其中的作用還有待于進一步討論。

本研究中，對JEG-3細胞給予了不同刺激物刺激，重點探討β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物是否能夠誘導(dǎo)JEG-3釋放黏附分子和趨化因子，以及TLR4-MyD88在其中發(fā)揮的作用。VCAM-1、ICAM-1作為黏附分子，正常妊娠時表達下降，而在流產(chǎn)發(fā)生時會顯著上升，從而誘導(dǎo)白細胞黏附聚集導(dǎo)致炎癥發(fā)生[15,16]。采用Western blot法和實時定量PCR對JEG-3中的VCAM-1、ICAM-1進行檢測，發(fā)現(xiàn)β2GPI/抗體β2GPI抗體復(fù)合物能夠顯著上調(diào)VCAM-1、ICAM-1的表達。IL-8作為典型的CXC亞家族的趨化因子，可趨化中性粒細胞到達炎癥部位，在APS的炎癥應(yīng)答中廣泛存在并且受到TLR4的調(diào)控[17]。通過ELISA和實時定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物上調(diào)趨化因子IL-8的表達，由此可見β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物能夠有效促進JEG-3細胞分泌趨化因子，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。一些同期研究主要關(guān)注抗β2GPI抗體在APS中的作用，本研究也采用抗β2GPI抗體刺激JEG-3細胞[1,7]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨的抗β2GPI 抗體相對Media組VCAM-1、ICAM-1、IL-8的表達也有所增高，但弱于β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物組，由此說明單獨的抗β2GPI抗體同樣可以促進JEG-3細胞分泌黏附分子和趨化因子。刺激效果弱的原因可能是由于JEG-3細胞體外培養(yǎng)時自身表達的β2GPI抗原弱于體內(nèi)環(huán)境引起的，而當β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物組加入了β2GPI抗原則使刺激效果更加顯著，但尚需進一步驗證。

已有研究證實抗β2GPI抗體能夠產(chǎn)生與LPS相同的刺激作用，顯著增加細胞TLR4 mRNA和蛋白表達水平[18]。使用Western blot法和定量PCR檢測JEG-3中TLR4-MyD88的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4-MyD88在JEG-3中均有表達，并且在β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物組及單獨的抗β2GPI抗體組中表達均顯著提高。這表明單獨的抗β2GPI抗體及β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物促進自身免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的作用可能依賴于TLR4-MyD88。采用TAK-242預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)VCAM-1、IL-8的表達明顯降低，進一步證實TLR4在JEG-3細胞分泌VCAM-1、IL-8中確實發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)在用無關(guān)抗體RIgG刺激JEG-3細胞時，VCAM-1、IL-8的表達也有所上升，但弱于復(fù)合物組和抗β2GPI抗體組。然而，無關(guān)抗體RIgG刺激細胞后TLR4和MyD88的表達相對于Media組并無區(qū)別。采用TAK-242預(yù)處理后，也沒有發(fā)現(xiàn)VCAM-1、IL-8的表達有明顯變化。這些都說明RIgG組作用的產(chǎn)生并不依賴于TLR4-MyD88途徑，推測這可能和JEG-3細胞表面的Fc受體有關(guān)，但尚待驗證。

綜上所述，本研究證明β2GPI/抗β2GPI抗體復(fù)合物能夠增強JEG-3的黏附分子及趨化因子表達，促進自身免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生，TLR4-MyD88在其中扮演重要角色。本研究為深入闡明該病的發(fā)病機制提供了有益參考，但是在該病的臨床防治效果以及治療方案方面還有待深入探討。