諾帝-褐藻酸鈉微球血管內(nèi)介入治療兔VX2肝癌

楊巧麗，游 箭，蒲洪波，廖運國，胡 鴻，魏 欣，何學(xué)紅

(1.重慶市婦幼保健院放射科，重慶 401120；2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院南充市中心醫(yī)院介入放射科，四川 南充 637000；3.貴黔國際總醫(yī)院介入科，貴州 貴陽 550018)

肝癌在全球癌癥相關(guān)死因中居第2位[1]。TACE是中晚期肝癌的首選治療方法[2]，但栓塞后腫瘤內(nèi)部缺血缺氧可逐漸誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[3]。諾帝是人工合成的類去甲二氫愈創(chuàng)木酸化合物，具有相似的結(jié)構(gòu)和生物效應(yīng)，對多種腫瘤及新生微血管具有抑制作用[4-5]。海藻酸鈉微球(kelp miero gelation, KMG)是新型栓塞劑，具有無毒、生物相容性較好及生物降解性等物理特性，已廣泛用于介入治療腫瘤。將抗腫瘤藥物包載于微球內(nèi)制成載藥緩釋微球，是當(dāng)前研究熱點[6]，可于目標(biāo)部位緩慢釋放藥物，保持穩(wěn)定的血藥濃度，提高腫瘤局部藥物生物利用度，減少給藥次數(shù)，降低全身毒副作用[7]。本研究探討諾帝-KMG血管內(nèi)介入治療兔VX2肝癌的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 健康新西蘭大白兔50只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，重慶渝達(dá)實驗兔場提供(重慶市實驗動物質(zhì)量合格證0002926)。VX2荷瘤兔由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。諾帝來自陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院病理研究所，KMG來自北京圣醫(yī)耀公司。將海藻酸鈉加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)中稀釋，將諾帝加入4% CaCl2溶液中快速攪拌至溶解(終濃度為5 mmol/L)，再將濃度為3.5%海藻酸鈉溶液逐漸滴加至配制好的CaCl2溶液中，劇烈攪拌，靜置4 h，離心，吸干微球表面水分，分離微球，低溫干燥，得到諾帝-KMG。

1.2 實驗兔模型建立 取出VX2荷瘤兔大腿內(nèi)側(cè)腫瘤組織，選取腫瘤邊緣活性較強(qiáng)的灰白色魚肉樣質(zhì)韌組織，剪成大小約1 mm3的組織。麻醉實驗兔后仰臥位保定，沿劍突偏左側(cè)1 cm逐層開腹，暴露肝左葉，用鑷子輕拉出肝左葉，眼科剪刺破肝左葉較厚部位形成竇道，植入2～3塊瘤塊，再用明膠海綿填塞。將肝左葉回納入腹腔后逐層縫合切口。術(shù)后肌肉注射抗生素3天預(yù)防感染。

1.3 儀器與方法 建模后2周行介入治療。采用GE DSA(LCV+)機(jī)，腹部造影模式，管電壓1 250 kV，管電流800 mA。將實驗兔隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組10只，麻醉后經(jīng)股動脈穿刺，經(jīng)由微導(dǎo)絲引入微導(dǎo)管，行腹主動脈(1 ml/s，3 s)、肝固有動脈(0.5 ml/s，3 s)造影，之后超選至靶血管灌注藥物，A、B、C、D、E組灌注藥物分別為生理鹽水、諾帝、KMG、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil， 5-FU)+KMG、諾帝-KMG 1 ml/kg體質(zhì)量，之后造影評估栓塞程度。

于治療前1天及之后2周行增強(qiáng)CT掃描。采用GE Lightspeed 16排螺旋CT機(jī)，管電壓100 kV，管電流100 mA，層厚1.25 mm，F(xiàn)OV 160 mm×160 mm，經(jīng)耳緣靜脈以0.5 ml/s速率注入非離子對比劑碘海醇5 ml，注射對比劑后13 s及70 s行肝臟雙期掃描，測量病灶最大徑(a)及最小徑(b)。

1.4 腫瘤體積增長率檢測 術(shù)后2周行CT增強(qiáng)掃描后處死實驗兔，取出肝臟及腫瘤，計算腫瘤體積V(V=1/2×a×b2)及體積增長率。體積增長率=(術(shù)后V-術(shù)前V)/術(shù)前V×100%。

1.5 病理學(xué)檢測 以4%甲醛溶液固定載瘤兔肝，石蠟包埋后切片，HE染色后觀察腫瘤組織鏡下表現(xiàn)，以免疫組織化學(xué)染色觀察血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)及CD31表達(dá)。采用Weidner計數(shù)法計算微血管密度(microvessel density， MVD)，在低倍鏡(×100)下選取血管“熱點”區(qū)，即胞質(zhì)內(nèi)含棕黃色顆粒的血管內(nèi)皮細(xì)胞(CD31陽性細(xì)胞)最密集的區(qū)域，于高倍鏡(×400)下在染色良好、背景清晰的視野內(nèi)計數(shù)，將孤立的血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇或管腔<50 μm的微血管視為1個腫瘤微血管，計數(shù)5個視野并取其平均值作為最終結(jié)果。VEGF陽性細(xì)胞占總細(xì)胞百分比<5%為陰性(-)，≥5%為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

50只兔均建模成功。D、E組各1只兔死于介入治療并發(fā)癥，A組1只因血管變異致手術(shù)失敗，最終納入47只兔。

術(shù)前CT平掃示實驗兔肝臟類圓形低密度影、邊界清楚，增強(qiáng)掃描呈明顯環(huán)形強(qiáng)化、中心密度較低(圖1)。術(shù)后2周兔肝癌體積不同程度增加，中心壞死更明顯，部分可見肝、肺內(nèi)小結(jié)節(jié)狀轉(zhuǎn)移灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖1 建模成功實驗兔增強(qiáng)CT圖像 圖2 介入治療前實驗兔DSA圖像 A.動脈期； B.實質(zhì)期

術(shù)前DSA示動脈期腫瘤動脈增多、增粗、紆曲，局部血管網(wǎng)聚集成團(tuán)呈“抱球征”(圖2A)，實質(zhì)期腫瘤由邊緣環(huán)形顯影逐漸呈結(jié)節(jié)狀顯影(圖2B)；術(shù)后腫瘤顯影消失，鄰近部分細(xì)小肝動脈未顯影。

2.1 腫瘤體積及體積增長率 術(shù)前1天各組兔腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后2周，各組實驗兔腫瘤體積及體積增長率總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，A、B組腫瘤體積及體積增長率均大于C、D、E組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組兔術(shù)前1天及術(shù)后2周腫瘤體積及體積增長率比較(±s)

表1 各組兔術(shù)前1天及術(shù)后2周腫瘤體積及體積增長率比較(±s)

組別體積(cm3)術(shù)前1天術(shù)后2周體積增長率(%)A組(n=9)1.42±0.237.71±0.54460.94±112.14B組(n=10)1.50±0.187.55±0.82435.27±105.71C組(n=10)1.44±0.173.94±0.34?#176.76±36.94?#D組(n=9)1.51±0.183.44±0.48?#131.82±47.90?#E組(n=9)1.55±0.213.28±0.33?#118.10±31.64?#F值0.83173.54427.61P值0.51<0.01<0.01

注：*：與A組比較，P<0.05；#：與B組比較，P<0.05

2.2 VEGF表達(dá)及MVD VEGF陽性細(xì)胞主要分布于瘤周及栓塞后殘存瘤組織內(nèi)，胞漿呈棕黃色、黃色或棕褐色，條索狀、彌漫狀或灶狀(圖3)。5組間VEGF陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，E組低于其他各組(P均<0.05)，C組高于其他各組(P均<0.05)，見表2。

鏡下可見孤立性棕黃色、棕褐色的血管內(nèi)皮細(xì)胞及由多個血管內(nèi)皮細(xì)胞聚集成的圓形、類圓形細(xì)胞簇或條索狀微小血管，其間相互交錯、連通(圖4)。5組間MVD總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，E組MVD低于與其他各組(P均<0.05)。

表2 各組兔腫瘤組織VEGF陽性率及MVD比較

3 討論

3.1 VEGF表達(dá)及MVD與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系 腫瘤生長過快超過腫瘤血管供給能力或腫瘤血管被阻斷時，腫瘤細(xì)胞缺血、缺氧，分泌以VEGF為主的大量促血管生長因子。VEGF作用多樣，與血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)-2結(jié)合后啟動下游信號通路，逐步介導(dǎo)腫瘤血管生成[8]、提高腫瘤血管通透性[9]而致MVD升高，使腫瘤細(xì)胞血供豐富而進(jìn)一步增殖，脫落的腫瘤細(xì)胞隨血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至全身其他部位。VEGF可多途徑、多步驟促進(jìn)微血管形成，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。研究[10-11]表明，在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF可通過自分泌方式與腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合，直接刺激腫瘤細(xì)胞增殖。Lesslie等[12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中的VEGF可與VEGFR-1受體結(jié)合，激活Src信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。肝癌為富血供腫瘤，腫瘤組織中VEGF高表達(dá)，腫瘤內(nèi)部微血管豐富。合理選用抗血管生成藥物，可以降低腫瘤促血管生長因子表達(dá)，與抑血管生長因子達(dá)到平衡，促進(jìn)腫瘤血管構(gòu)筑表型向正?；D(zhuǎn)歸，降低MVD，提高療效[13]。

圖3各組兔肝癌組織VEGF免疫組織化學(xué)圖(×400) A～E.分別為A～E組圖4各組兔肝癌組織CD31免疫組織化學(xué)圖(×400) A～E.分別為A～E組

3.2 諾帝-KMG 諾帝可抑制腫瘤血管生成及生長，給藥方式包括靜脈滴注及動脈內(nèi)灌注。靜脈滴注創(chuàng)傷小，但全身血藥濃度及毒副作用大；動脈內(nèi)灌注為有創(chuàng)性治療，但局部血藥濃度高、全身毒副作用小，可在抑制腫瘤血管生成的同時阻斷腫瘤血供，使腫瘤細(xì)胞缺乏營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)而“餓死”。何學(xué)紅等[14]以攜帶諾帝的聚乙烯醇(PVA)顆粒栓塞兔VX2肝癌，術(shù)后實驗兔不良反應(yīng)較輕，腫瘤體積較對照組(注射生理鹽水)及TACE組(注射碘化油乳劑+順鉑)明顯減小，血清VEGF顯著降低，提示其用于栓塞治療肝癌安全有效，不僅能明顯抑制腫瘤生長，還能減少腫瘤血管生成。但PVA顆粒作為一種永久栓塞劑，具有膨脹速度快、易堵管、在體內(nèi)不可降解等缺點，其對子宮肌瘤的效果不及KMG[15]。

本研究成功將諾帝包載于栓塞劑KMG中，制成諾帝-KMG聚合物，用于血管內(nèi)介入栓塞治療兔VX2肝癌，較好地控制了腫瘤體積，僅1只兔出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥而死亡，提示其相對安全、有效。

3.3 諾帝-KMG對VEGF、MVD的影響 TACE是治療中晚期肝癌的首選方法，通過栓塞腫瘤供血動脈而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧性壞死，并于局部灌注化學(xué)治療藥物而直接殺死腫瘤細(xì)胞[2]；但VEGF與肝癌TACE術(shù)后復(fù)發(fā)存在相關(guān)性[16]，TACE術(shù)后常因VEGF高表達(dá)而誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，使遠(yuǎn)期療效欠佳[3]。本研究C、D組VEGF、MVD最高，鏡下呈密集陽性表達(dá)，原因可能為栓塞后腫瘤內(nèi)部因缺血缺氧而刺激VEGF分泌，形成大量新生微血管，與相關(guān)報道[17]相符；B組VEGF、MVD雖低于A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示單次經(jīng)導(dǎo)管灌注諾帝可能在一定程度上抑制VEGF生成，但作用時間短、效果有限；E組VEGF、MVD最低，表明諾帝-KMG物理特性良好，于病變部位持續(xù)緩慢釋放諾帝，腫瘤內(nèi)部持續(xù)接受諾帝作用，生物利用度高，可明顯抑制腫瘤內(nèi)部VEGF生成，MVD也因此降低。本研究C、D、E組腫瘤體積增長率均低于A、B組，證實介入治療對控制肝癌體積增長具有顯著療效；D、E組術(shù)后腫瘤體積增長率低于C組，提示諾帝具有一定抗腫瘤細(xì)胞生長作用，且與5-Fu無顯著差別。

綜上所述，諾帝-KMG是安全有效的載藥栓塞劑，可抑制兔VX2肝癌TACE術(shù)后VEGF表達(dá)及新生血管形成，且在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞生長。