人參多糖提取分析方法及生物活性研究進(jìn)展

李萬叢，艾芷伊，游 穎，范靜靜，黃 婧，王玉華

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

0 引言

“人參之用，其史久也，其效妙也，其途廣也，其譽(yù)盛也”[1]。早在4 000年前《神農(nóng)本草經(jīng)》就已經(jīng)對人參的生理功能進(jìn)行了介紹，主要調(diào)養(yǎng)心肝脾肺腎，對智力的提升也有一定療效[2]。明朝時期，《本草綱目》中記錄人參對頭暈、嘔吐、體虛有一定的療效[3]。根據(jù)當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)研究，人參既具備增強(qiáng)心肌、降低血糖、促進(jìn)造血機(jī)能和提高腎上腺皮質(zhì)功能，同時也具有提高人體免疫力、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等功能。人參的成分構(gòu)成豐富，不僅包括人參皂苷、多糖、氨基酸，也包括酚類、一些微量元素和腺苷等[4]。其中，普遍認(rèn)為人參中起主要作用的是人參皂苷[5]。近幾年的研究表明，人參多糖因具有抗腫瘤、抗氧化、免疫作用等而受到重視[6-8]。從而對人參多糖也進(jìn)行相關(guān)研究，綜述人參多糖目前的研究進(jìn)展。

1 人參多糖提取與分析研究進(jìn)展

1.1 人參多糖提取方法

人參多糖的提取與其他多糖的提取大致相同，通常采用化學(xué)、物理和生物3種方式進(jìn)行提取。其中，化學(xué)法具體可分為稀酸、稀堿或有機(jī)試劑提取法；物理法則方法繁多，不僅有微波輔助提取、超濾膜法提取和超臨界輔助熱水浸提法[9-10]，還可采取加熱回流法提取、超聲輔助法提取[11]和濕法粉碎法提??；生物法主要包括酶解提取[12]和微生物法提取?；瘜W(xué)法酸堿度不宜控制，會帶來環(huán)境污染及試劑殘留，對環(huán)境壓力較大而且會威脅到人體健康。物理法由于全過程不使用有機(jī)溶劑，進(jìn)行水提時提取物中無溶劑殘留，也不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，應(yīng)用相對安全可靠、試驗成本較低，而且具有操作過程連續(xù)、整體周期較短的優(yōu)點，同時能夠有效避免試驗提取過程中，有害物質(zhì)對試驗操作者的損傷，以及對周圍環(huán)境等的破壞和污染，但對儀器設(shè)備要求較高，如對設(shè)備壓力和密封程度均有較高要求且設(shè)備投資大、耗費成本。另外，物理法可能會產(chǎn)生一定的降解作用，破壞生物大分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其變性甚至失活，進(jìn)而影響藥物有效成分的生理活性。生物法包括酶法和微生物法提取，酶法提取的特點是能夠在一定程度上提高人參中所含藥物有效成分的提取率。酶法提取具有對試驗設(shè)備無特殊要求、溫和條件下即可分解植物組織和增強(qiáng)有效藥用活性成分轉(zhuǎn)化的優(yōu)點。同時，酶法提取也具有一定的局限性，由于影響酶活性的因素較多并且不易控制，導(dǎo)致酶法提取對試驗設(shè)備無特殊要求，但對條件要求較高。具體試驗表現(xiàn)是，當(dāng)試驗條件較為適宜時，酶的活性高，催化能力強(qiáng)；反之，當(dāng)試驗條件不宜時，其催化效力變?nèi)?，甚至是失活。微生物法提取操作簡單、反?yīng)條件溫和、成本較低、對環(huán)境友好，且能提高藥效、改變藥性、降低毒副作用，勢必成為新的發(fā)展趨勢。

1.1.1 化學(xué)法提取人參多糖

化學(xué)法提取人參多糖主要采用稀酸、稀堿、有機(jī)試劑等，主要通過試劑的充分作用，使得植物細(xì)胞吸水膨脹，達(dá)到一定程度后，細(xì)胞破裂釋放出多糖。酸堿法提多糖因酸堿度不易控制會使糖苷遭到破壞，從而使其得率下降，且會腐蝕容器，并造成環(huán)境污染，所以很少采用該方法提取人參多糖。宋利華等人[13]采用水提、酸提、堿提3種方法提取人參多糖，提取率分別為6.207%，1.222%，3.893%。一般采用水提醇沉法，以醇沉法為例，提取的主要步驟包括浸泡過夜→熱水浸提→離心→濃縮→醇沉→離心→除蛋白→有機(jī)溶劑萃取沉淀→冷凍干燥。

1.1.2 物理法提取人參多糖

物理法提取人參多糖主要有微波、超聲和超臨界輔助提取等，微波法的本質(zhì)采用電磁波貫穿介質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞之內(nèi)，汲取能量后，出現(xiàn)溫度升高、壓力增大等現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞破裂。同時，微波激發(fā)分子轉(zhuǎn)動，分子間發(fā)生摩擦碰撞，產(chǎn)生大量熱能，進(jìn)一步加速細(xì)胞破裂，在電磁場的作用下，使目標(biāo)物加速溶出。超聲法主要利用超聲波作用于植物細(xì)胞時產(chǎn)生的氣泡或空穴發(fā)生爆破或閉合后，產(chǎn)生巨大的壓力并釋放大量的熱，將細(xì)胞壁迅速破壞撕裂，使細(xì)胞內(nèi)部所含目標(biāo)產(chǎn)物得以釋放和溶解，進(jìn)而獲得更高的提取率。超臨界CO2萃取主要是借助壓力、溫度，在超臨界情況下將極性大小、分子量大小及沸點不同的組分依次萃取分離，然后通過減壓升溫等過程將流體轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w，從而實現(xiàn)分離純化之目的[14]。例如，吳瓊等人[15]通過微波法提取人參多糖的得率為19.86%，與使用熱水作為溶劑提取時相比，人參多糖得率提高7.32%。鐘振聲等人[16]通過超聲波法提取人參多糖，當(dāng)原料粒度80目，料液比1∶50，功率200 W，時間30 min時，所提取多糖含量較之傳統(tǒng)煎煮法高2.3%；時間縮短到傳統(tǒng)煎煮法的1/6，多糖提取效率及提取效果均有顯著提高。張艷榮等人[17]通過超臨界輔助提取人參多糖，對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，采用最優(yōu)條件原料-夾帶劑比例1∶2.5（g∶mL）等條件時，人參多糖的提取率為38.03%±1.43%，多糖純度為54.71%±2.16%，與水提法進(jìn)行對比，多糖提取率和純度分別提高了16.15%和13.44%。綜合以上幾種方法，發(fā)現(xiàn)超臨界輔助提取法人參多糖得率最佳，且這種方法沒有化學(xué)試劑殘留，綠色安全。但對試驗操作要求較高，且儀器耗費較高。

1.1.3 生物法提取人參多糖

生物法提取人參多糖，主要通過2種方法，一個是酶法提取，一個是微生物法提取。其中，酶法提取一般是用合適的酶對試驗樣品進(jìn)行預(yù)處理，將構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素、半纖維素等進(jìn)行分解，進(jìn)而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使局部溶解和疏松的現(xiàn)象得以產(chǎn)生，使細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)對于溶劑提取的阻力得以降低，使提取效率加快。微生物法提取是利用微生物復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，不但可以產(chǎn)生有益的副產(chǎn)物，反應(yīng)條件溫和、綠色安全、提取效率高，而且操作簡便，前后處理均較為簡單。郭特[18]利用α-淀粉酶提取人參多糖，人參多糖WGPE得率為9%，純度為72.5%。薛俊杰等人[19]以蛹蟲草為菌株對人參進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明發(fā)酵后人參多糖的得率明顯提升。目前，我國對于采用微生物提取人參多糖的方法尚處于起步階段，因此綠色安全的微生物提取法將會是今后研究的重中之重。

1.2 人參多糖的分離純化

人參多糖內(nèi)包含有一定的雜質(zhì)，多為蛋白質(zhì)和色素。脫蛋白的方法較多，常用有機(jī)溶劑或合適的酶等方法進(jìn)行去除。有機(jī)溶劑除雜的本質(zhì)是使蛋白質(zhì)變性失活，酶法除雜則是將大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)。色素主要采用氧化、吸附、離子交換、反膠束萃取等方式進(jìn)行去除。其中，氧化法主要采用雙氧水作為氧化劑，此種方法雖然操作簡單，但無法將氧化脫色后的色素分離出去，吸附法采用吸附劑除去雜質(zhì)，在眾多的吸附劑中，聚酰胺去除色素的效果最佳。另外，反膠束法和離子交換法的應(yīng)用也較為普遍。除雜后的人參多糖仍然是聚合度不同的混合物，為獲取人參多糖的單一級分，需對初步除雜后的多糖進(jìn)行分離，如離子交換色譜、凝膠色譜、透析法等。其中，較常用的有2種，一是離子交換色譜，二是凝膠色譜。張向平[20]經(jīng)過初步提取獲得粗多糖除雜后，獲得人參總糖，再經(jīng)DEAE-Cellulose柱分離得到酸性人參多糖GRA和中性人參多糖GRN。中性人參多糖總糖含量為97.8%。

1.3 人參多糖結(jié)構(gòu)分析

人參多糖有效成分主要是酸性糖和中性糖，中性糖主要是淀粉，由葡萄糖聚合而成；酸性糖大多是果膠、人參果膠有3種分型，分別是RG-Ⅰ，RG-Ⅱ和HG，其中HG僅由半乳糖醛酸組成，其他2種分型除了含有半乳糖醛酸外，還含有鼠李糖。結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)活性也不盡相同，因此深入剖析人參多糖結(jié)構(gòu)成為研究結(jié)構(gòu)活性的前提。人參多糖同核酸類似，按照復(fù)雜程度，可分為4個等級，主要包括單糖組成及比例，糖醛酸含量及種類，有無側(cè)鏈，側(cè)鏈連接位點，側(cè)鏈中官能團(tuán)數(shù)量及種類等。目前，結(jié)構(gòu)分析主要停留在一級結(jié)構(gòu)，通常采用物理和化學(xué)法進(jìn)行分析，高級結(jié)構(gòu)還有待研究，可以借鑒其他多糖高級結(jié)構(gòu)的分析方法用于人參多糖的分析。

多糖結(jié)構(gòu)分析方法見表1。

表1 多糖結(jié)構(gòu)分析方法

2 人參多糖生物活性的研究進(jìn)展

2.1 人參多糖免疫活性的研究進(jìn)展

多糖刺激后，活化的巨噬細(xì)胞通過分泌作為癌癥抑制因子的細(xì)胞因子并調(diào)節(jié)IL-1β等細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的分泌，在先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。Kallon S等人[21]研究了人參多糖（GPS） 是否可以通過提高免疫力來抵抗禽流感病毒（H9N2 AIV）對雞的影響時發(fā)現(xiàn)，MHCII和IL-2等細(xì)胞因子的表達(dá)呈上升趨勢。這些結(jié)果表明，通過預(yù)處理CEF，GPS可以通過增強(qiáng)免疫力促進(jìn)機(jī)體的抗病毒活性。余建云等人[22]通過對80例Ⅱb～Ⅳa期宮頸癌患者分組觀察，得出人參多糖在宮頸癌同步放化療的同時能使患者更好地接受治療，避免因放化療嚴(yán)重不良反應(yīng)而中斷治療或延長治療時間所致的療效降低，還可以降低直腸炎的程度及延緩其發(fā)生的時間。

2.2 人參多糖抗腫瘤活性的研究進(jìn)展

Cai J P等人[23]在研究人參多糖（PGPW1） 對人胃癌細(xì)胞系HGC-27的抗侵襲和轉(zhuǎn)移作用時發(fā)現(xiàn)，pgpw1可以量效地抑制HGC-27細(xì)胞侵襲和遷移。此外，Western blot結(jié)果顯示pgpw1可以抑制Twist蛋白（腫瘤相關(guān)蛋白） 和AKR1C2（癌基因） 的表達(dá)，并且觀察到NF1的增加，這些結(jié)果表明PGPW1具有抗腫瘤活性。Wang J等人[24]在研究人參多糖對K562，HL-60或KG1α腫瘤細(xì)胞的影響時，經(jīng)GPS處理后，小鼠PM中CD68，ACP和α-ANE的表達(dá)增加。此外，包括TNF-α等在內(nèi)的細(xì)胞因子水平升高，一氧化氮（NO） 的濃度增強(qiáng)。畢蕾等人[25]通過人參水提液（WEG）、人參多糖（GPS）、人參皂苷（GTS） 對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs） 與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系中肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞骨架的影響研究，探討人參抗腫瘤的作用機(jī)制?？偠灾@些結(jié)果表明，GPS通過刺激巨噬細(xì)胞而產(chǎn)生了有效的抗腫瘤活性。

2.3 人參多糖降血糖活性的研究進(jìn)展

Niu J等人[26]在研究水溶性人參多糖（WGP） Ⅱ型糖尿?。═2DM）大鼠的影響時，檢測了尿液中的影響物質(zhì)，用WGP處理后，1-甲基腺嘌呤、四氫皮質(zhì)醇、4-脫氧硫酸、5-羥基己酸水平均有不同程度的減少，而5-羥色胺、肌苷十二烷二酸等有顯著提升。這些結(jié)果均表明，WGP有降血糖活性。Jiao L等人[27]研究了人參多糖對血糖的影響，經(jīng)人參多糖處理后，患病小鼠的體重、肝糖原等顯著增加，同時TG、TC、丙二醛（MDA） 水平與正常小鼠相比顯著降低，而維C和維E的濃度及GSH-Px的活性均明顯升高。陳艷等人[28]研究了人參水提物對正常小鼠血糖和血脂代謝的影響及其對四氧嘧啶（ALX）致糖尿病小鼠降血糖的作用。試驗證實，200 mg/kg和400 mg/kg人參水提物極顯著地降低了血糖。還具有改善正常小鼠的葡萄糖耐量，降低糖尿病小鼠血糖值的作用。結(jié)果表明，人參多糖有降血糖活性。

2.4 其他功能

人參多糖除具有上述功能外，還具有保護(hù)心臟、保肝、抗氧化、抗衰老、防止疲勞、抗補(bǔ)體活性、細(xì)胞保護(hù)活性等功能。

Jiao L等人[27]研究GPII和GPIII 2種人參多糖的抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)GPII和GPIII的羥基自由基清除活性比維C高，對1,2,3-phenriol的自氧化與維C等效。Song JY等人[29]研究了人參多糖對肝臟功能的影響，人參多糖處理后，NPSH水平升高，CYP450水平下降，HO活性增強(qiáng)，CYP450活性降低。結(jié)果表明，人參多糖對雌小鼠的肝臟代謝及抗氧化具有調(diào)節(jié)作用。Wang J等人[30]在評估人參多糖的抗疲勞活性時，對小鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗，經(jīng)人參多糖處理的小鼠，GPx，SOD，GLU水平升高，CK，LDH，MDA，TG水平均下降，表明人參多糖有抗疲勞的功效。李珊珊等人[31]通過水提法得到人參果中的總多糖（WGBP），并通過離子交換層析對 WGBP進(jìn)行分離純化。WGBP主要由鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、半乳糖 （galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）和葡萄糖（glucose，Glc） 組成。WGBP具有明顯的DPPH自由基和羥自由基清除活性，且清除率隨質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)WGBP質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率為62.7%；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，羥自由基清除率為81.2%。WGBP對DPPH自由基和羥自由基清除活性優(yōu)于4個子級分。

3 結(jié)語

人參多糖因具有眾多的生物活性而受到廣泛關(guān)注，傳統(tǒng)的人參多糖提取方法耗時較長、分離純化困難，人參多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，與之相對應(yīng)的功效機(jī)制也尚未研究清楚，因此建立一整套快速、簡便、經(jīng)濟(jì)高效并保證多糖活性的提取分離方法便成為多糖工業(yè)化生產(chǎn)的首要前提，微生物提取法綠色環(huán)保、反應(yīng)溫和、操作簡單，為以后的研究指明了方向，除此之外，與其相關(guān)的功能性食品種類較少，大眾認(rèn)知度較差，這就要求科研單位和相關(guān)機(jī)構(gòu)加大科研和宣傳力度，開辟更為廣闊的新型功能性食品市場。