骨膜蛋白基因敲除鼠正畸牙齒移動(dòng)模型的建立及驗(yàn)證

郭薇，房付春，徐會(huì)勇，歐陽鈞

1.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，廣東廣州510510；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科，廣東廣州510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，廣東廣州510515

前言

牙齒在正畸治療過程中，牙周膜受到機(jī)械力刺激發(fā)生改建，眾多細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和生長因子參與這一過程［1-3］。我們前期研究證實(shí)在機(jī)械力刺激下牙周膜中的骨膜蛋白（Periostin,PN）表達(dá)水平顯著升高，且其表達(dá)與TGF-β1相關(guān)［4］。有研究表明，PN作為TGF-β1的下游因子，具有趨化心肌細(xì)胞，促進(jìn)膠原合成和成熟，形成穩(wěn)定的膠原網(wǎng)絡(luò)和參與膠原重塑的功能［5-6］。PN主要通過刺激TGF-β1信號(hào)系統(tǒng)參與反饋機(jī)制，由αv-整合素陽性成纖維細(xì)胞表達(dá)。生成的蛋白能進(jìn)一步增加成纖維細(xì)胞的流動(dòng)性、收縮性和合成基質(zhì)蛋白的能力。PN成為這個(gè)反饋機(jī)制中的板機(jī)點(diǎn)［7-8］。TGF-β1信號(hào)相關(guān)通路是否也在正畸牙齒移動(dòng)過程中介導(dǎo)PN對(duì)牙周膜的改建作用?基于以上問題，本研究擬通過小鼠正畸牙齒移動(dòng)模型和基因敲除小鼠正畸牙齒移動(dòng)模型研究TGF-β1--PN牙周膜相關(guān)信號(hào)通路分子，進(jìn)一步揭示PN對(duì)牙周膜在機(jī)械力作用下改建的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立

實(shí)驗(yàn)所需的PN 基因敲除小鼠是中國科學(xué)院廣州分院生物醫(yī)藥與健康研究院李鵬研究員惠贈(zèng)，為C57 轉(zhuǎn)基因基因敲除鼠。所有動(dòng)物的飼養(yǎng)及繁殖條件為室溫18～25 ℃，濕度40%～60%。每天應(yīng)給予足夠的鼠糧，飲用水經(jīng)121 ℃、30 min高壓滅菌，每周至少更換墊料2次，保證其干凈。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)前期結(jié)果［4］，本實(shí)驗(yàn)選擇5 d加力效應(yīng)最大時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)分為C57小鼠未加力組5只、C57小鼠加力5 d組5只，加力方法同實(shí)驗(yàn)一［9］；基因敲除小鼠組上頜加力牙組5只、未加力牙5 d組5只，飼養(yǎng)條件同實(shí)驗(yàn)一。將實(shí)驗(yàn)小鼠按實(shí)驗(yàn)要求處死后拔出牙齒放于盛有裂解液的EP管中，并搔刮牙槽窩去組織于EP管中。

1.3 顯微CT（Micro-Computed Tomography, Micro-CT）影像學(xué)檢查

處死未加力12周齡的C57和PN基因敲除小鼠，分離上下頜骨，分別選取各組小鼠上、下頜骨。每組標(biāo)本都貼上標(biāo)簽并固定在特殊的掃描管中，以防止滑動(dòng)影響掃描效果。斷層掃描成像采用Micro-CT（uCT80）成像系統(tǒng)。選擇小視場成像掃描，校正斷層掃描值，電源功率設(shè)置為30 W，電流為429 μA，掃描電壓為70 kV，掃描層厚為20 μm，每次掃描一個(gè)下頜骨大約需要20 min。掃描后，文件存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中，供后續(xù)觀察與分析［10］。

1.4 PN基因敲除小鼠基因型的鑒定

PN基因敲除小鼠基因型鑒定的PCR引物為：

mPN1:5'-CCTTGCCAGTCTCAAYGAAGG-3'

mPN2:5'-TGACAGAGTGAACACATGCC-3'

mPN3:5'-GGAAGACAATAGCAGGCATGCTG-3'

按照mPN1：mPN2：mPN3=2：1：1 的比例混合后加入ddH20稀釋成10倍工作液后使用。以上引物由Invitrogen 公司合成。

1.5 RT-PCR 檢測小鼠牙移動(dòng)牙周膜改建中與PN 相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控因子

1.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank提供的相關(guān)序列，應(yīng)用Primer primier 5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST軟件同源性分析選擇特異性引物，由Invitrogen 公司合成。引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

1.5.2 從組織樣本中提取總RNA 用于提取總RNA的容器都已經(jīng)進(jìn)行去Rnase 處理。加樣槍及玻璃器皿 已 用 RNaseZapTM （Rnase Decontamination solution）試劑處理；用含1/1 000 DEPC無菌水浸泡塑料制品24 h，經(jīng)兩次120 ℃、30 min 條件進(jìn)行高壓滅菌，60 ℃烤干；1/1 000比例的去離子水加入DEPC處理24 h后，高壓消毒［11］。

1.5.3 逆轉(zhuǎn)錄 取100 ng～2 μg總RNA，加入2 μL gDNA Remover，用移液器輕柔吹打5～10 次混勻，室溫（19～27 ℃）反應(yīng)5 min，置于冰上待用；向gDNARemover處理過的總RNA中加入5 μL的4x RT Master Mix，然后加ddH2O補(bǔ)足至20 μL；加好試劑后，用移液器輕柔吹打10次充分混勻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃、15 min。

1.5.4 RT-PCR RT-PCR 反應(yīng)體系如表2所示。利用上述逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，采用特異的引物擴(kuò)增，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR，檢測基因敲除小鼠牙周膜組織中PN、FAK、TGF-β1 等基因的mRNA 表達(dá)水平；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸34 s，35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后得Ct值。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析 用2-△△Ct方法進(jìn)行RT-PCR結(jié)果分型，得到相關(guān)基因表達(dá)差異值。對(duì)每個(gè)樣本的Ct值算得平均值后（3復(fù)孔求平均值），通過減去各自內(nèi)參的平均Ct值得到△Ct值。減去需要比較的兩個(gè)樣本之間的△Ct值得到△△Ct值。計(jì)算2-△△Ct，得到相關(guān)基因表達(dá)差異倍數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 13.0軟件，采用單樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較，取α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

表2 RT-PCR反應(yīng)體系Tab.2 RT-PCR reaction system

2 結(jié)果

2.1 基因敲除小鼠的鑒定

小鼠基因組DNA經(jīng)PCR電泳后的結(jié)果如圖1所示，C57 小鼠的DNA 樣本放置于1 泳道，用于鑒定的基因小鼠的DNA樣本放置于2泳道。從圖中可以看出1 泳道只有一個(gè)亮度很強(qiáng)的目的條帶，其范圍在691bp處，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定為WT小鼠；2泳道也只有一個(gè)亮度較強(qiáng)的目的條帶，范圍在500bp 左右，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定為PN-/-小鼠（基因敲除小鼠）。試驗(yàn)中所用基因敲除小鼠必須經(jīng)過基因鑒定后才能使用。

圖1 小鼠基因組PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Mice genomic PCR identification results

2.2 Micro-CT影像學(xué)檢查結(jié)果

小鼠Micro-CT 三維重建圖顯示：與對(duì)照組C57小鼠相比，PN-null 小鼠（基因敲除小鼠）牙周組織破壞，牙槽骨出現(xiàn)明顯的水平吸收，磨牙根分叉區(qū)完全暴露（圖2a 和圖2b）。小鼠Micro-CT 曲面斷層圖顯示：與對(duì)照組C57小鼠相比，PN-null小鼠牙周組織破壞，牙槽骨出現(xiàn)明顯的吸收，牙槽脊頂消失，牙周膜連續(xù)性中斷破壞（圖2c和圖2d）。

圖2 Micro-CT影像學(xué)檢查結(jié)果Fig.2 Examination results of Micro-CT

2.3 小鼠牙移動(dòng)牙周膜改建中與PN相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控因子

根據(jù)圖3所示，與C57未加力對(duì)照組相比，C57小鼠牙加力實(shí)驗(yàn)組牙周膜中PN mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024）；粘著斑激酶（Focal Adhesion Kinase, FAK）mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027）；TGF-B1 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025）。

與PN-null未加力對(duì)照組相比，PN-null加力實(shí)驗(yàn)組牙周膜中FAK mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016）；TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。與PN-null未加力對(duì)照組相比，C57未加力組牙周膜中TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著減少，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），F(xiàn)AK mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）。與PN-null加力組相比，C57加力實(shí)驗(yàn)組牙周膜中TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著減少，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）；FAK mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。

3 討論

圖3 RT-PCR檢測C57和PN-null小鼠加力和不加力牙周膜TGF-β1、FAK和PN mRNA水平的表達(dá)Fig.3 The mRNA levels of TGF-β1,FAK and PN in the periodontal ligament of C57 and PN-null mice with or without receiving orthodontic force detected by RT-PCR

建立生物研究模型在生物醫(yī)學(xué)等各方面的研究中都非常重要?；蚯贸夹g(shù)通常用于某種特定基因缺失的研究模型［12］，借助細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和動(dòng)物胚胎學(xué)的技術(shù)，通過胚胎干細(xì)胞將生物正常的功能基因的編碼區(qū)破壞，使特定基因失活，從而研究該基因的功能［13］；還可以通過外源基因來替換研究宿主基因組，以便測定其是否具有類似的功能，從而進(jìn)行相關(guān)的研究［14］。人類很多疾病都由基因決定，因此構(gòu)建相應(yīng)的基因敲除動(dòng)物模型是研究人類疾病的理想方法［15］。本實(shí)驗(yàn)為了清楚了解PN在小鼠牙移動(dòng)牙周膜改建中的作用以及相關(guān)信號(hào)通路，通過檢測PN基因敲除后相關(guān)通路調(diào)控因子表達(dá)的變化，從而研究PN在小鼠牙移動(dòng)牙周膜改建中的角色，這需要對(duì)建模用的PN-null小鼠進(jìn)行鑒定。PN+/+基因型小鼠基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為691bp，PN-/-基因型小鼠基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為500bp，本實(shí)驗(yàn)中1泳道放置C57小鼠的DNA樣本，2泳道放置作鑒定的基因小鼠DNA樣本，可以看出1泳道只有一個(gè)亮度很強(qiáng)的目的條帶，其范圍在691bp處，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定為WT小鼠；2泳道也只有一個(gè)亮度較強(qiáng)目的條帶，范圍在500bp左右，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)判定為PN-/-小鼠，可用作后期的進(jìn)一步研究。

Micro-CT是利用X線成像原理的新型高分辨率三維成像設(shè)備，它可以通過牙齒和骨骼等硬組織的高分辨率X線成像獲得高精度的三維圖像，且不會(huì)損壞樣本，可對(duì)結(jié)構(gòu)、密度和體積進(jìn)行定量分析［16-17］。與普通CT相比，Micro-CT可以利用錐形X光束獲得真正的各向同性體積圖像，從而提高空間分辨率和射線利用率，該技術(shù)可以在樣品完好的情況下對(duì)骨骼、牙齒和生物材料進(jìn)行高分辨率（＜10 μm）X線成像，并獲得詳細(xì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，從而進(jìn)行各部分的三維重建圖像。Micro-CT擁有的圖像處理軟件可以從任意角度觀察研究對(duì)象的三維圖像和斷層圖像，定量計(jì)算樣本內(nèi)選定區(qū)域的孔隙率、連接密度、面積、結(jié)構(gòu)模型及體積指數(shù)等指標(biāo)［18］。Micro-CT廣泛應(yīng)用于骨形態(tài)和骨量的各種研究，包括骨生長發(fā)育分析、腎性骨病和骨質(zhì)疏松癥等病理狀態(tài)的動(dòng)物模型分析、三維血管重建下的骨折愈合分析及關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)分析等［19］。

本實(shí)驗(yàn)采用Micro-CT 對(duì)C57 小鼠和PN-null 小鼠進(jìn)行上下頜骨掃描三維重建發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組C57小鼠相比，PN-null小鼠牙周組織破壞，牙槽骨出現(xiàn)明顯的水平吸收，磨牙根分叉區(qū)完全暴露。小鼠Micro-CT曲面斷層圖顯示：與對(duì)照組C57小鼠相比，PN-null小鼠牙周組織破壞，牙槽骨出現(xiàn)明顯的吸收，牙槽脊頂消失，牙周膜連續(xù)性中斷破壞。僅僅把PN基因敲除，沒有其他任何干預(yù)的情況下，基因敲除小鼠在正常咀嚼力作用下牙周組織出現(xiàn)嚴(yán)重破壞，充分說明PN 在維持牙周膜等牙周組織完整性方面不可或缺，它在牙周膜、牙周組織的改建更新中扮演著非常關(guān)鍵的角色，可能會(huì)調(diào)控其他信號(hào)分子影響牙周組織的代謝，這與Rios等［20］研究結(jié)果基本一致。

根據(jù)前期的研究，我們知道牙周組織的改建是牙周膜對(duì)不同機(jī)械力產(chǎn)生反應(yīng)的結(jié)果。牙周膜是怎樣將這種機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)的呢？牙周膜為復(fù)雜、多細(xì)胞和血管的軟結(jié)締組織，包含許多獨(dú)立的細(xì)胞群。主要細(xì)胞類型是內(nèi)皮細(xì)胞，包括馬拉色上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、感覺細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞［21-22］。研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、生長因子等在這一過程中起著非常重要的作用。PN是一種新發(fā)現(xiàn)的多功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)PN是牙周內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和承受機(jī)械應(yīng)力后重塑所不可缺少的［23］。PN作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，能影響細(xì)胞的遷移、細(xì)胞外基質(zhì)合成、細(xì)胞粘附、細(xì)胞的增殖與凋亡等［24］。研究表明PN可與I型膠原直接相互作用，透射電子顯微鏡和形態(tài)分析表明，PN基因敲除小鼠皮膚真皮層的膠原纖維直徑減小，形成異常的I型膠原纖維。此外，差示掃描量熱法顯示PN基因敲除小鼠中膠原蛋白變性溫度較低，反映交聯(lián)膠原蛋白水平降低。這些結(jié)果表明PN可以調(diào)節(jié)I型膠原纖維形成，從而成為纖維結(jié)締組織生物力學(xué)性質(zhì)的重要介質(zhì)［25］。

目前，PN與TGF-β1的關(guān)系受到各界越來越多的關(guān)注。許多研究表明PN參與多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展，其表達(dá)與TGF-β1密切相關(guān)［26］。現(xiàn)已公認(rèn)TGF-β 1可誘導(dǎo)PN的高表達(dá)，說明PN可能作為TGF-β1的下游因子發(fā)揮作用，但TGF-β1誘導(dǎo)其表達(dá)的機(jī)制還不清楚。研究結(jié)果顯示在PN基因敲除小鼠情況下TGF-β1表達(dá)反而升高，說明TGF-β1作為PN調(diào)控基因的上游參與機(jī)械力對(duì)牙周膜改建的過程，其在PN基因敲除小鼠因?yàn)镻N基因缺失，作為上游的調(diào)控因子會(huì)按照原始意圖代償增加PN的量以彌補(bǔ)其表達(dá)不足，因此PN-null小鼠的TGF-β1表達(dá)升高，可能是通過下游信號(hào)因子PN負(fù)反饋引起，這與Sen等［27］研究基本一致。

本研究發(fā)現(xiàn)與PN-null未加力對(duì)照組相比，C57未加力組牙周膜中FAK mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，與PN-null加力組相比，C57加力實(shí)驗(yàn)組牙周膜中FAK mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)。說明FAK mRNA在PN基因敲除其在牙周膜的表達(dá)量減少，二者具有一致性，說明FAK是PN調(diào)控信號(hào)通路的下游分子，接受PN調(diào)控參與機(jī)械力對(duì)牙周膜改建的過程。但是FAK在PN基因敲除小鼠情況下牙周膜中仍然有表達(dá)，說明FAK可能除PN信號(hào)通路之外，還接受其它上游因子調(diào)控參與正畸力對(duì)牙周膜改建的過程，也就是說在牙周膜接受應(yīng)力刺激進(jìn)行改建過程中，F(xiàn)AK并不是單一的只有TGF-β1--PN--FAK信號(hào)通路，還接受其它信號(hào)通路參與牙周膜改建。這與Hakuno等［28］研究基本一致，研究發(fā)現(xiàn)，PN敲除鼠梗死區(qū)邊緣AKT磷酸化形式的單體顯著減少，梗死區(qū)邊緣僅表達(dá)少量FAK磷酸化形式，提示心肌成纖維細(xì)胞PN蛋白趨化是通過FAK-AKT磷酸化途徑實(shí)現(xiàn)的。以上研究提示我們有可能在正畸作用下牙周膜的改建過程，其中一個(gè)信號(hào)調(diào)控通路可能是TGF-β1--PN--FAK信號(hào)通路通過AKT磷酸化來激活細(xì)胞外基質(zhì)的改變。由于在QCR不能對(duì)P-AKT進(jìn)行檢測，而且小鼠牙周膜過少也難以進(jìn)行P-AKT蛋白水平功能檢測。人牙根粗大，牙周膜面積大，有足夠的牙周膜組織進(jìn)行蛋白功能水平檢測，因此通過人牙周膜加力改建進(jìn)行蛋白水平檢測可以進(jìn)一步在蛋白功能水平深入探討PN在正畸牙齒移動(dòng)過程中牙周膜改建作用機(jī)制。

綜上所述，PN 參與調(diào)控了正畸作用下牙周膜的改建過程，是保持牙周膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性所必需的，TGF-β1--PN--FAK信號(hào)通路參與調(diào)控了正畸作用下牙周膜的改建過程，PN作為TGF-β1調(diào)控通路的下游，其可能通過負(fù)反饋機(jī)制引起TGF-β1 在PN 基因敲除小鼠表達(dá)升高，F(xiàn)AK可能通過除PN信號(hào)通路之外的其他途徑參與正畸力對(duì)牙周膜改建的過程。