miR-214與MIR31HG在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

韓云，毛宇強(qiáng)，徐然，王一北，石岱旺，石文君

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的的惡性腫瘤，根據(jù)國家癌癥中心公布的2015年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,新發(fā)肺癌患者達(dá)73.33萬[1]，且發(fā)病率有逐漸增高的趨勢，雖然近年來手術(shù)、放化療及分子靶向治療取得較大進(jìn)展，但肺癌病死率仍較高，5年生存率為20.99%[2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常見病理類型，但約70%患者診斷時(shí)已為中晚期，尋找無創(chuàng)、耗時(shí)短、靈敏度高的篩查方法對早期診斷NSCLC具有重要的意義，因此，有必要深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制。微小RNA(micro RNAs，miR)是一類長度為18～25個(gè)核苷酸的小型內(nèi)源非編碼RNA，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控，與腫瘤、免疫、炎性反應(yīng)等病理生理過程有關(guān)[3]。有學(xué)者在非小細(xì)胞肺癌癌株A549、H1299發(fā)現(xiàn)miR-214表達(dá)降低的現(xiàn)象，當(dāng)miR-214過表達(dá)時(shí)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，這與miR-214能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸的RNA調(diào)控因子，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，因此尋找關(guān)鍵lncRNA對于NSCLC的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義[5]。LncRNA MIR31HG，又稱為Loc554202，位于9p21.3，在結(jié)直腸癌、NSCLC等多種腫瘤中存在表達(dá)增高的現(xiàn)象[6-7]，通過激活Wnt /β-鈣黏蛋白信號通路，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用。本研究通過檢測NSCLC癌組織中miR-214、MIR31HG的表達(dá)，分析兩者與臨床病理特征之間的關(guān)系，初步探討其臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年2月—2017年2月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療的104例NSCLC患者的臨床資料。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有NSCLC患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷；(2)入選患者均為初次診治，既往未接受過放化療、免疫治療等抗腫瘤治療；(3)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有急性感染性疾病，如泌尿系感染、呼吸道感染等；(2)合并其他器官惡性腫瘤；(3)合并嚴(yán)重的心、肝、肺、腎等器官功能不全。本組患者男61例，女43例，年齡31～79(57.12±7.61)歲；腺癌71例，鱗癌33例；腫瘤TNM分期參考第七版美國癌癥聯(lián)合會NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)[8]：Ⅰ期29例，Ⅱ期37例，Ⅲ期38例；組織學(xué)分級：高分化29例，中分化35例，低分化40例；腫瘤直徑≤5 cm者58例，>5 cm者46例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法 收集104例患者術(shù)中獲取的部分癌組織，以距離癌組織3 cm以上的癌旁組織96份作為對照，將其置于凍存管內(nèi)液氮罐速凍后，轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后置于-80℃冰箱保存。各取約100 mg組織，采用Trizol法提取組織中總RNA。紫外分光光度計(jì)測定RNA溶液的吸光度值鑒定其濃度及純度，將合格的總RNA置于-80℃冰箱保存。以總RNA為模板，用TaqMan RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。miR-214特異性莖環(huán)引物正向序列：5'-CACCGCATCCGCTCACCTGTACAGC-3'，反向引物序列：5'-AAACGCTGTACAGGTGAGCGGATGC-3'，內(nèi)參基因U6上游引物序列：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'，下游引物序列：3'-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-5'；MIR31HG上游引物序列：5'-TTCTGTCCTCCTACTCGGACCC-3'，下游引物序列：5'-CCTCCAGAGTTTGGTTTTGTGTC-3'，以GAPDH作為內(nèi)參照，上游引物序列：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物序列：5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3'?？偡磻?yīng)體系20 μl，包括2 μl cDNA，0.1 μl TaqDNA聚合酶、1 μl上下游引物、1 μl 20×SYBR Green Ⅰ及0.4 μl濃度為10 mmol/L dNTPs。熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均在ABI7900實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次。采用相對Ct值方法進(jìn)行計(jì)算：表達(dá)量=2-ΔΔCt。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織中miR-214、MIR31HG表達(dá)比較 癌組織miR-214相對表達(dá)量低于癌旁組織(P<0.01)，而MIR31HG相對表達(dá)量高于癌旁組織(P<0.01),見表1。

2.2 癌組織中miR-214、MIR31HG表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 癌組織中miR-214、MIR31HG表達(dá)與腫瘤分期及組織學(xué)分級有關(guān)(P均<0.01)，而與患者病理類型、腫瘤直徑及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。腫瘤分期為Ⅲ期、低分化癌組織中miR-214表達(dá)水平分別低于腫瘤分期為Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌組織(P均<0.01)。腫瘤分期為Ⅲ期、低分化癌組織中MIR31HG表達(dá)水平分別高于腫瘤分期為Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌組織(P均<0.01)，見表2。

表1 癌組織與癌旁組織中miR-214、MIR31HG表達(dá)比較

表2 癌組織中miR-214、MIR31HG表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 癌組織中miR-214與MIR31HG表達(dá)的相關(guān)性 NSCLC癌組織中miR-214相對表達(dá)量與MIR31HG的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.618，P=0.000，95%CI0.487～0.741)，見圖1。

圖1 癌組織中miR-214與MIR31HG相對表達(dá)量的相關(guān)性

2.4 miR-214與MIR31HG對NSCLC預(yù)測價(jià)值分析

以癌旁組織為陰性樣本(n=96)、以癌組織為陽性陽本(n=104)，再將miR-214及MIR31HG水平劃分成8個(gè)組段，建立ROC曲線分析模型。經(jīng)ROC曲線分析，miR-214及MIR31HG對NSCLC的發(fā)生具有較高的預(yù)測價(jià)值，AUC均在0.8左右。在其理論閾值點(diǎn)處，敏感度均大于0.8，特異度均大于0.7。見表3、圖2。

表3 miR-214與MIR31HG對NSCLC預(yù)測價(jià)值分析

3 討 論

非編碼RNA(包括lncRNA、miRNA等)在癌癥起始和進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，參與調(diào)節(jié)多條信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[9]。在NSCLC中已經(jīng)鑒定出多種lncRNA表達(dá)異常的現(xiàn)象[10-11]，以往研究報(bào)道MIR31HG在多種癌癥中發(fā)揮著不同的作用，如在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和血漿中發(fā)現(xiàn)MIR31HG顯著上調(diào)，通過抑制MIR-31的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[12]。此外，在NSCLC中發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達(dá)的變化，如miR-214、miR-141及miR-224等，miRNA可以與靶基因3′UTR區(qū)域的特定靶點(diǎn)結(jié)合改變靶基因mRNA的生物穩(wěn)定性，直接抑制靶基因mRNA的翻譯過程，引起下游信號傳導(dǎo)分子表達(dá)異常，可參與炎性反應(yīng)、免疫、代謝及腫瘤等多個(gè)病理生理過程[13-14]。

本研究中，NSCLC癌組織中miR-214的相對表達(dá)量低于癌旁組織，目前其表達(dá)降低的機(jī)制尚不清楚，可能與長鏈非編碼RNA催化組蛋白賴氨酸三甲基化(H3K27me3)并導(dǎo)致靶基因miRNA的轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)，進(jìn)而使下游PTEN/AKt信號通路活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15-16]。本研究結(jié)果表明，NSCLC癌組織中miR-214的表達(dá)與腫瘤分期及組織學(xué)分級有關(guān)，腫瘤分期Ⅲ期、低分化癌組織中miR-214表達(dá)水平分別低于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌組織(P均<0.01)。其機(jī)制可能是lncRNA如SNHG6作為內(nèi)源性競爭性RNA表達(dá)增加，與miR-214結(jié)合并抑制其抑癌作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子EZH2的表達(dá)，而SNHG6基因的拷貝數(shù)增加多發(fā)生于高級別、進(jìn)展期惡性腫瘤中，與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[17]。miR-214的表達(dá)可以在轉(zhuǎn)錄后、翻譯后水平受其他因子的調(diào)控。本研究中，癌組織中miR-214的相對表達(dá)量與MIR31HG的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，其原因可能是MIR31HG作為miR-214的靶基因，miR-214結(jié)合于MIR31HG mRNA，降低mRNA穩(wěn)定性，減少M(fèi)IR31HG表達(dá)，而腫瘤細(xì)胞中miR-214表達(dá)下降，對MIR31HG表達(dá)抑制作用減弱。

圖2miR-214與MIR31HG表達(dá)的ROC曲線

MIR31HG是一種長度> 2 166個(gè)核苷酸的lncRNA，在胰腺導(dǎo)管腺癌中MIR31HG表達(dá)升高，表現(xiàn)出原癌基因的潛能，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。研究表明，MIR31HG表達(dá)上調(diào)通過EGFR/PI3K/AKT信號通路增加了NSCLC細(xì)胞系中的吉非替尼耐藥性[19]。本研究癌組織中MIR31HG相對表達(dá)量高于癌旁組織，其機(jī)制可能是腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子SP1表達(dá)增加，其能夠結(jié)合MIR31HG基因啟動子區(qū)域并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[20]。本研究癌組織中MIR31HG表達(dá)與腫瘤分期及組織學(xué)分級有關(guān)，腫瘤分期Ⅲ期、低分化癌組織中MIR31HG表達(dá)水平分別高于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌組織(P均<0.01)。結(jié)果表明MIR31HG表達(dá)隨著分期和組織學(xué)分級的升高而表達(dá)增加，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而在沉默MIR31HG表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移能力降低[21]。其機(jī)制可能是MIR31HG促進(jìn)相關(guān)蛋白信號通路的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞增殖并發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。MIR31HG的高表達(dá)水平可能提示患者預(yù)后不良和較短生存時(shí)間，但本研究為回顧性分析，未對研究對象進(jìn)行隨訪觀察，在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步考察患者的復(fù)發(fā)及生存情況。

ROC曲線分析表明miR-214及MIR31HG的敏感度和特異度均較高，具有一定的預(yù)測價(jià)值。但本研究僅是利用了NSCLC患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行研究，不足之處在于：一是沒有設(shè)置獨(dú)立的陰性對照樣本(最好是初步診斷為NSCLC，但在術(shù)中病理被否定的患者樣本);二是本研究獲取的是組織樣本，而沒有獲取血液樣本。因此，以后將進(jìn)行進(jìn)一步的研究，既設(shè)立獨(dú)立對照組，也采集和分析各樣本的血液資料。

綜上所述，NSCLC癌組織中miR-214及MIR31HG均異常表達(dá)且呈負(fù)相關(guān)，兩者共同參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程，有希望成為新的診斷、治療及評估預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，但兩者的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：無