丹東地區(qū)常見魚類水霉菌的分離、純化、鑒定及拮抗菌的篩選

馮春明 楊笑談 馬德利

摘要：水霉病是一類全球分布的魚類疾病，目前池塘養(yǎng)殖尚沒有有效、安全的防治方法。為探究水霉病的生物防治方法，以丹東地區(qū)發(fā)生水霉病的魚體分離出的水霉致病菌為指示菌，對(duì)從土壤、水樣中分離純化獲得的62株放線菌、17株細(xì)菌進(jìn)行平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，獲得2株對(duì)水霉致病菌抑制效果最好的拮抗菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，分別為淡紫灰鏈霉菌（S.lavendulae）及特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis），均對(duì)魚類無毒力。

關(guān)鍵詞：魚類;水霉;拮抗菌

水霉病是由霉菌的侵入感染導(dǎo)致的真菌性魚病，常見的病原菌為水霉屬和綿霉屬的一些種類，一年四季均可發(fā)生，是一類全球分布的魚類疾病[1]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了不可估算的危害。當(dāng)魚體表面因外界因素導(dǎo)致傷口時(shí)，霉菌在水中產(chǎn)生的游動(dòng)孢子便隨機(jī)侵入魚體，形成菌絲寄生于壞死組織中，分泌消化酵素分解周圍組織，使魚體組織潰爛、壞死，最終導(dǎo)致魚類死亡。

避免人為操作損傷是預(yù)防水霉病的主要手段，此外觀賞魚水霉病可采用升溫、提高鹽度等方法抑制[2-4]，但池塘養(yǎng)殖魚類仍沒有有效、安全的防控方法。本研究旨在分離純化水霉病致病菌，篩選拮抗菌，研究水霉病的生物防治方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

患病鯉魚、泥鰍取自丹東市寬甸滿族自治縣某養(yǎng)殖場(chǎng)和東港椅圈鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場(chǎng)，經(jīng)充氧運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行解剖和水霉菌分離。

1.2水霉菌分離培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：土豆0.20 kg、葡萄糖0.02 kg，瓊脂粉0.015～0.020 kg，蒸餾水1 L，用于水霉病病原菌的分離、純化培養(yǎng)。

1.3水霉病病原菌的分離純化

無菌狀態(tài)下，取病魚胸鰭、尾鰭、背鰭、肌肉組織的患病部分，接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察水霉病病原菌的菌絲生長情況，取無污染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接純化1～2次。

1.4病原菌觀察

用接種環(huán)挑取適量菌絲，用美蘭染色液進(jìn)行染色，3～4 min后在顯微鏡下鏡檢，觀察并記錄菌落形態(tài)。

1.5分子生物學(xué)鑒定

真菌模板制備：取50 μL真菌PCR裂解液于滅菌的離心管中，用無菌接種環(huán)或移液槍頭挑取單個(gè)菌落，放置于裂解液中震蕩數(shù)次后取出。80 ℃的水浴鍋中熱變性15 min，采用低速離心（5 000 r/min）10 min，PCR反應(yīng)的模板為裂解后的上清液。

PCR反應(yīng)體系為 50 μL：Premix Taq（EX Taq Version 2.0） 25 μL， 模板DNA（裂解上清液）2 μL，引物Forward primer （10 μmol/L） ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）1 μL ，Reverse primer （10 μmol/L） ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）1 μL，dd H2O加21 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。

1.6水霉拮抗菌分離、篩選

共采集20份土壤、水樣品，采用平板稀釋分離法，分離純化獲得放線菌62株、細(xì)菌17株。以分離純化的水霉菌為指示菌，采用平板對(duì)峙法，篩選拮抗效果良好的拮抗菌。

1.7水霉拮抗菌鑒定

對(duì)篩選出來的拮抗菌的16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，序列比對(duì)，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征及16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，最終確定拮抗菌種類。

1.7.1拮抗菌16S rDNA序列擴(kuò)增采用通用引物（27f： 5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3;1 492 r：5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3）進(jìn)行16 S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（50 μL）：1×Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA模板1 μL（0.1～10 ng），引物（10 μmol/L）各2 μL，dd H2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后于-20 ℃冰箱保存。

1.7.2拮抗菌16S rDNA序列測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行純化，雙向測(cè)序并拼接輸出全序列。

2結(jié)果

2.1菌落

分離的水霉病病原菌單菌落，見圖1。

2.2水霉病病原菌顯微形態(tài)

在顯微鏡下，水霉呈現(xiàn)交錯(cuò)縱橫的絲狀結(jié)構(gòu)，在菌絲中有很多個(gè)細(xì)胞核，中間不存在橫隔，相當(dāng)于一個(gè)多核細(xì)胞，見圖2。

2.3水霉病病原菌DNA序列

以分離菌DNA為模板，ITS1和ITS4為引物擴(kuò)增了長度約為1.1 kbp的目的片段，見圖3。

2.4水霉病病原菌測(cè)序比對(duì)結(jié)果

分離菌序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，與寄生水霉（Saprolegnia parasitica）序列相似程度達(dá)98.80%。

2.5水霉拮抗菌分離篩選結(jié)果

試驗(yàn)篩選獲得2株拮抗效果良好的拮抗菌：DTJ-24和7#，拮抗效果見圖4、圖5。

2.6水霉拮抗菌鑒定

根據(jù)拮抗菌DTJ-24和7#的16S rDNA片段序列，使用Genebank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)分析，確定水霉拮抗菌DTJ-24為淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）; 7#為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）。

3討論

對(duì)患病的鯉魚、泥鰍體表及肌肉進(jìn)行致病菌分離，均獲得較純的致病菌，經(jīng)美蘭染色顯微鏡觀察和分子生物學(xué)鑒定，顯示該致病菌均為寄生水霉（S. parasitica），說明丹東地區(qū)水霉病致病菌主要為寄生水霉。

水霉病是水產(chǎn)養(yǎng)殖影響最廣泛的一種疾病，多發(fā)生在養(yǎng)殖生物受傷后。大部分水產(chǎn)養(yǎng)殖生物在受傷后可自愈，說明水環(huán)境中微生物對(duì)水霉在魚體表的寄生有一定的拮抗性。近年來，微生態(tài)制劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物疾病的預(yù)防與治療作用也受到越來越多的關(guān)注[5-6]。生物防治方法避免了利用藥物治療引起的藥物殘留、急性應(yīng)激等方面問題。

本研究以分離出的水霉致病菌為指示菌，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選出兩株拮抗效果良好的細(xì)菌，鑒定得知兩株菌分別為淡紫灰鏈霉菌（S. lavendulae）及特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）。我們對(duì)泥鰍魚進(jìn)行了兩種拮抗菌的高濃度浸泡及注射感染試驗(yàn)，泥鰍魚無死亡，確定分離的拮抗菌對(duì)魚類無毒力，可用于防控魚類水霉病。

參考文獻(xiàn)：

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