小丑魚繁殖生物學(xué)研究進(jìn)展

劉亞娟，胡 靜，馬振華

( 1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 570218；2.農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300； 3.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384 )

小丑魚別稱?？~，屬鱸形目、雀鯛科、?？~亞科魚類，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)把該亞科分成雙鋸魚屬(Amphiprion)及棘頰雀鯛屬(Premna)[1]。Allen[1]描述了已發(fā)現(xiàn)的雙鋸魚屬魚類有27種，近年又發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新物種[2-3]，迄今雙鋸魚屬有29種；全世界棘頰雀鯛屬僅1種，?？~亞科總計(jì)2屬30種。

小丑魚是一類具有較高觀賞價(jià)值的熱帶珊瑚礁魚類，其色彩美麗且性情溫和，健壯活潑且易飼養(yǎng)。鑒于其特殊的雄性先熟的性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象、強(qiáng)領(lǐng)域性行為和獨(dú)特的與海葵共生關(guān)系，過去30年里小丑魚繁殖生物學(xué)始終是研究的熱點(diǎn)，特別是在雄性先熟的性轉(zhuǎn)化研究方面受到了極大的關(guān)注[4-14]。隨著研究技術(shù)的不斷改進(jìn)，近年來有關(guān)性轉(zhuǎn)化分子生物學(xué)方面的研究取得了一定的進(jìn)展[15-18]。除此之外，小丑魚繁殖生物學(xué)中包括繁殖季節(jié)、產(chǎn)卵量、求偶和產(chǎn)卵行為也取得了一定的突破。筆者從小丑魚繁殖習(xí)性、性別分化、產(chǎn)卵與孵化3方面對小丑魚的繁殖生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行剖析,以期為小丑魚規(guī)模化養(yǎng)殖工作的開展提供啟示，同時(shí)將豐富珊瑚礁魚類的繁殖生物學(xué)研究，進(jìn)而為珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 繁殖習(xí)性

由于各海區(qū)條件不同，繁殖期也不同。關(guān)于小丑魚的繁殖季節(jié)，研究者們已經(jīng)分別對熱帶地區(qū)[4-5,7,10]、亞熱帶海區(qū)[10,19]和日本溫帶海區(qū)[8,9,20]的情況作了調(diào)查研究。在熱帶海區(qū)，小丑魚呈現(xiàn)典型的非季節(jié)性產(chǎn)卵模式，產(chǎn)卵周期表現(xiàn)出較明顯的月周期或半月周期特性[4,7]；溫帶地區(qū)的小丑魚則存在短暫的產(chǎn)卵季節(jié)[21-22]；亞熱帶海區(qū)小丑魚的產(chǎn)卵模式則介于兩者之間[10]；溫帶和亞熱帶海區(qū)小丑魚產(chǎn)卵高峰與海區(qū)水溫同步，表現(xiàn)出比較弱的月規(guī)律性。雖然不同種類小丑魚產(chǎn)卵高峰期是一致的，但同地區(qū)不同種類間以及同種類不同親體間的產(chǎn)卵季節(jié)也存在較大差異，如澳大利亞東海岸的熱帶種類寬帶雙鋸魚(A.latezonatus)產(chǎn)卵只限于夏、秋季，而相同區(qū)域的本地特有種大堡礁雙鋸魚(A.akindynos)則可以整年產(chǎn)卵[10]；同處于日本海域的克氏雙鋸魚(A.clarkii)不同親體產(chǎn)卵季節(jié)也有所不同[8,20-23]。

2 性別分化

2.1 性腺發(fā)育途徑

小丑魚是雌雄同體雄性先熟魚類，即首先發(fā)育成雄性，經(jīng)過一定的環(huán)境及種群演變，最后轉(zhuǎn)化為雌性，與雌性先熟魚類恰恰相反[24-25]。其性轉(zhuǎn)化模式也為雀鯛科魚類生活史中特有[6]。繁育過程中，領(lǐng)域內(nèi)雌小丑魚缺失時(shí)，雄性就不可逆地反轉(zhuǎn)為雌性。另有研究表明，某些情況下幼魚能夠越過雄魚階段，直接變成雌魚[26]。該現(xiàn)象一般發(fā)生在雌、雄魚均離開魚巢或幼魚所到新巢穴中雄魚和雌魚均十分弱勢的情況下。Hattori等[26]觀察了日本海域克氏雙鋸魚社會(huì)等級(jí)行為，發(fā)現(xiàn)雌魚缺失后，雄魚往往會(huì)尋找另一個(gè)宿主海葵中的雌魚重新配對，原社群中的幼魚或者未激活的雄魚直接發(fā)育成雌魚，并終身保有雌性功能。領(lǐng)域中已有配對且居主導(dǎo)地位時(shí)，其余小丑魚會(huì)暫時(shí)處于無性別狀態(tài)。甚至有些小丑魚可能一生都是無性別狀態(tài)，主要取決于其營養(yǎng)與環(huán)境。

2.2 性腺發(fā)育過程

綜合組織學(xué)研究結(jié)果，小丑魚性腺發(fā)育可以分為以下幾個(gè)階段[26-29]：(1)未成熟幼魚性腺，初級(jí)卵母細(xì)胞卵巢占性腺的大部分，同時(shí)具有非功能性精巢組織；(2)亞成體腺，擁有一些功能性精囊和初級(jí)生長階段的卵母細(xì)胞，沒有可分辨的卵巢片層；(3)成熟雄魚性腺為兩性性腺，具備成熟的精巢 (內(nèi)含不同發(fā)育階段的精母細(xì)胞)及未成熟的卵巢(有卵原細(xì)胞卵囊及卵黃發(fā)生前期卵母細(xì)胞組織)；(4)性轉(zhuǎn)化時(shí)期性腺，精巢組織退化，出現(xiàn)大量的游動(dòng)精子，卵巢發(fā)育充滿卵黃發(fā)生前期卵母細(xì)胞；(5)成熟前期雌魚，具有卵巢腔和含卵片層，只有周邊核仁期卵母細(xì)胞，沒有精母細(xì)胞、精細(xì)胞或者精子；(6)成熟雌魚，擁有卵巢及產(chǎn)卵片層，具有發(fā)育階段不同的卵母細(xì)胞，而精巢縮小至很小的一條窄帶，退化的組織包圍著性腺?？筛鶕?jù)有無卵黃期卵母細(xì)胞這一階段又分為兩個(gè)時(shí)期(Ⅰ和Ⅱ),雌性成熟Ⅱ期包含有卵黃形成期卵母細(xì)胞，而Ⅰ期中不含。

與其他雙性魚類性腺發(fā)育相比，小丑魚性腺發(fā)育的主要特殊性為：性腺首先分化為卵巢，然后在卵巢中發(fā)育精巢，形成雙性性腺；在雙性性腺中，精巢和卵巢之間沒有結(jié)締組織薄膜隔開[28]，而其他雙性魚類性腺一般都有結(jié)締組織薄膜隔開精巢和卵巢。

2.3 影響性腺發(fā)育的因素

影響小丑魚親魚性腺發(fā)育的生態(tài)因素主要有水溫[30]、溶解氧[31]、鹽度[32]、營養(yǎng)[33-35]、人為干擾[36]等。營養(yǎng)是決定魚類性腺發(fā)育的關(guān)鍵因素。人工養(yǎng)殖條件下，小丑魚親魚性腺發(fā)育主要與餌料的營養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)。餌料種類及食餌量是性腺發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，是卵子質(zhì)量的決定因素[37]。小丑魚體型較小，無法通過注射激素方法解決性腺發(fā)育問題，一般采用添加餌料促性腺發(fā)育物(如魷魚、深海魚油、卵磷脂、VG-微生物滋養(yǎng)劑、維生素E等)來促進(jìn)性腺發(fā)育。必需脂肪酸對親魚繁殖和仔魚存活極為重要，親魚餌料中需要足量的高不飽和脂肪酸，才能保證獲得較大的懷卵量。給小丑魚投喂對蝦、對蝦+牡蠣、對蝦+魷魚等餌料組合，發(fā)現(xiàn)新鮮蝦肉加魷魚肉的組合能滿足種魚繁殖期間對餌料的要求[33]。而在克氏雙鋸魚的促熟培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)對蝦+牡蠣混合投喂，親魚繁殖效果更好[38]。

溫度是影響小丑魚成熟和產(chǎn)卵的另一重要因素。小丑魚的適宜繁殖水溫在26～28 ℃，眼斑雙鋸魚(A.ocellaris)在24～30 ℃[36]。低溫(13～16 ℃)抑制小丑魚的繁殖，溫度降至24 ℃時(shí)，棘頰雀鯛(Premnasbiaculeatus)產(chǎn)卵間隔時(shí)間明顯延長[37]，即使較小的溫度波動(dòng)，對其繁殖的影響也很大。換水時(shí)溫差過大可導(dǎo)致魚苗無法破膜而死亡[31]。不同的光照條件對親魚的性腺發(fā)育影響不同。鮑鷹等[37]在培育棘頰雀鯛親魚中發(fā)現(xiàn)，相同光周期下，水面光照度2000 lx與500 lx時(shí)受精卵的發(fā)育明顯不同。低光照度下受精卵孵化時(shí)間延長，孵化率低。光照14 h+黑暗10 h下，小丑魚性腺發(fā)育較好。親魚缸內(nèi)無機(jī)鹽(主要為磷酸鹽和硝酸鹽)含量過高時(shí)，藻類大量滋生，難以清潔，影響繁殖過程。繁殖環(huán)境中硝酸鹽質(zhì)量濃度應(yīng)小于30 mg/L；亞硝酸鹽氮應(yīng)小于0.01 mg/L。人工養(yǎng)殖條件下，?？蜕汉鞑⒉皇切〕篝~賴以生存和繁殖的必需條件，小丑魚可以獨(dú)立存活和繁衍，而?？蜕汉鞯拇嬖诳梢栽鰪?qiáng)其安全感，增加產(chǎn)卵次數(shù)[33]。應(yīng)盡量減少環(huán)境因素對繁殖親魚的干擾，如人為走動(dòng)等，也要避免不同的親魚產(chǎn)生保護(hù)領(lǐng)地的行為，帶來環(huán)境的緊迫，而不利于其產(chǎn)卵[36]。

3 產(chǎn)卵與孵化

3.1 產(chǎn)卵行為

在產(chǎn)卵前幾日，小丑魚攻擊行為更加劇烈，并為產(chǎn)卵場所做準(zhǔn)備[4,39-41]。產(chǎn)卵期來臨時(shí)，小丑魚種魚，尤其是雄魚，在巢穴附近用嘴細(xì)啄仔細(xì)地清除巖石上的藻類和污物，用尾、胸鰭拂去砂礫用作未來的產(chǎn)卵床。性成熟時(shí)，雌魚的輸卵管及雄魚的交配器顯著突出。產(chǎn)卵日親魚食量明顯減少，雌魚腹部突出幾毫米長的輸卵管，并不時(shí)碰撞巖石摩擦自身腹部，隨后產(chǎn)卵, 卵粒黏附在卵床上。雄魚在卵粒上磨擦射精，雄雌魚交替產(chǎn)卵、射精。受精卵孵化過程中，親魚用嘴清除壞卵，用腹鰭、胸鰭擺動(dòng)扇動(dòng)水流，卵四處搖擺，去除卵上污物，充分接觸氧氣。親魚護(hù)卵直至仔魚孵出。其間大部分由雄魚看護(hù)，雌魚偶爾有看護(hù)行為[42]。

3.2 產(chǎn)卵間隔與時(shí)間

小丑魚性成熟后，前幾次產(chǎn)卵間隔較長且卵量較少，3～10次后，趨于穩(wěn)定。白條雙鋸魚(A.frenatus)[42]、眼斑雙鋸魚[36]、棘頰雀鯛[33]在適宜的培養(yǎng)條件下，均能常年連續(xù)產(chǎn)卵。白條雙鋸魚的正常產(chǎn)卵間隔為10～20 d，眼斑雙鋸魚為9～13 d，棘頰雀鯛為9～15 d。若餌料不適合或攝食量較少時(shí)，產(chǎn)卵間隔延長到20 d。水質(zhì)出現(xiàn)大幅度變化、移缸或魚齡老化后，產(chǎn)卵間隔逾30 d[30]。白條雙鋸魚[42]產(chǎn)卵高峰期是在9:00—11:00，棘頰雀鯛[33]一般約在11:00，眼斑雙鋸魚[36]一般下午產(chǎn)卵。研究發(fā)現(xiàn)，如果把每日的光照時(shí)間提前，設(shè)定在4:00～6:00，親魚的產(chǎn)卵時(shí)間也會(huì)提前至7:00—9:00。這表明產(chǎn)卵時(shí)間與日出時(shí)間有關(guān)，產(chǎn)卵總是發(fā)生在日出后2～4 h[42]。

3.3 產(chǎn)卵次數(shù)與產(chǎn)卵量

小丑魚單次產(chǎn)卵量與親魚個(gè)體、水質(zhì)狀況、飼料營養(yǎng)有很大關(guān)系。培育條件好, 水質(zhì)穩(wěn)定，則產(chǎn)卵量和孵化率高，反之則產(chǎn)卵量和孵化率低。正常情況下，眼斑雙鋸魚、白條雙鋸魚[42]和棘頰雀鯛每次分別產(chǎn)卵500～1000粒、800～1500粒和1500～2500粒[30]。在產(chǎn)卵季節(jié)，小丑魚一般每月產(chǎn)卵1～2次。位于西太平洋馬紹爾群島的橙鰭雙鋸魚(A.chrysopterus)、頸環(huán)雙鋸魚(A.perideraion)和?？p鋸魚(A.percula)平均每年產(chǎn)卵12～24次[4]；關(guān)島的黑雙鋸魚(A.melanopus)每年產(chǎn)卵24次[7]。亞熱帶海區(qū)的寬帶雙鋸魚每年產(chǎn)卵1～14次，平均8次；大堡礁雙鋸魚每年產(chǎn)卵2～15次，平均6～7次[10]。而位于溫帶地區(qū)(如日本海區(qū))的小丑魚，每年產(chǎn)卵4～9次[9,21,43]。溫帶和亞熱帶海區(qū)產(chǎn)卵季節(jié)比較短，年產(chǎn)卵次數(shù)少。雖然熱帶海區(qū)小丑魚產(chǎn)卵次數(shù)高于溫帶和亞熱帶地區(qū)，但目前還沒有數(shù)據(jù)表明，熱帶海區(qū)小丑魚年產(chǎn)卵量高于溫帶和亞熱帶海區(qū)。小丑魚不僅有區(qū)域和種類差異，同區(qū)域同種類不同親體之間的產(chǎn)卵次數(shù)和產(chǎn)卵量也存在較大差異?？耸想p鋸魚雌魚個(gè)體大小與年產(chǎn)卵次數(shù)呈負(fù)相關(guān)[9]。在水族箱中人工控制溫度，幾乎整年產(chǎn)卵，春秋季節(jié)產(chǎn)卵量增加。

3.4 受精卵的特征

小丑魚卵呈長橢圓形的膠囊狀結(jié)構(gòu)，黏性，是典型的端黃卵，卵徑約3 mm。白條雙鋸魚[42]的受精卵(2.62 mm×0.96 mm)明顯大于眼斑雙鋸魚(1.8 mm×0.8 mm)、頸環(huán)雙鋸魚(1.93 mm×0.8 mm)和克氏雙鋸魚(2.14 mm×0.9 mm)，盤狀卵裂，卵膜無色透明，在長軸即卵的動(dòng)物極一端，有纖維狀的附著絲，附著在產(chǎn)卵床上[4,39-41]。位于植物極一端的卵黃，內(nèi)含一個(gè)大油球及多個(gè)大小不等的小油球。在良好的培養(yǎng)條件下，卵為鮮艷的橙色或橘紅色，24 h后附著端發(fā)育為尾部，頭部向外，隨水流四處搖擺，接近孵化時(shí)出現(xiàn)銀色的虹膜。孵化通常在日落后1.5 h至2 h，由雄魚不斷扇動(dòng)卵塊或人工微充氣來完成[37]。

3.5 胚胎發(fā)育

目前有關(guān)黑雙鋸魚[44]、鞍斑雙鋸魚(A.polymnus)[45]、眼斑雙鋸魚[46-47]、頸環(huán)雙鋸魚[48]、海葵雙鋸魚[49]、白條雙鋸魚[42]、淺色雙鋸魚(A.nigripes)[50]、背紋雙鋸魚(A.akallopisos)[51]等的胚胎發(fā)育已有報(bào)道。小丑魚胚胎發(fā)育的一般過程見表1。

表1 眼斑雙鋸魚的胚胎發(fā)育[47]

3.6 孵化方式

產(chǎn)卵后，視魚缸的大小、產(chǎn)卵地點(diǎn)、養(yǎng)殖模式、環(huán)境狀況等，可選擇親魚孵化或進(jìn)行人工孵化。

3.6.1 親魚孵化

親魚單獨(dú)養(yǎng)殖且魚缸較小，循環(huán)系統(tǒng)獨(dú)立可控，無敵害生物如水螅體等，溫度光照可調(diào)的情況下應(yīng)盡量選擇親魚孵化。雜質(zhì)和細(xì)菌污染會(huì)造成部分魚卵死亡，親魚會(huì)清除這些死卵及雜質(zhì)，避免其影響周圍卵的發(fā)育。人工孵化難以完美模擬親魚扇動(dòng)水流的頻率與強(qiáng)度，所以親魚孵化的孵化率顯著高于人工孵化[52]。親魚孵化時(shí)應(yīng)選擇在白天光照時(shí)觀察胚胎發(fā)育，盡量避免在黑暗環(huán)境發(fā)育時(shí)光照觀察。入夜后，大量幼魚孵出，應(yīng)派人留守。剛孵化的仔魚體質(zhì)較弱，微弱刺激就會(huì)被沖擊而死，故接近孵出時(shí)關(guān)燈后應(yīng)關(guān)閉循環(huán)系統(tǒng)數(shù)小時(shí)；若關(guān)燈后3～4 h仍無幼魚孵出，說明當(dāng)日幼魚不會(huì)孵出，可恢復(fù)系統(tǒng)循環(huán)。初孵仔魚有被親魚吞吃的危險(xiǎn)，孵出后應(yīng)與親魚分養(yǎng)。剛孵化的白條雙鋸魚有趨光性，觀察到孵出后，在背離卵的一側(cè)水面進(jìn)行光照，吸引孵出的小丑魚，用吸管收集，轉(zhuǎn)入其他容器飼養(yǎng)。

3.6.2 人工孵化

若附卵的礁石容易取出，光照和溫度等條件可以滿足時(shí)，可人工孵魚。人工操作時(shí)模擬水流能力較差且未能及時(shí)取出壞卵，胚胎發(fā)育前期應(yīng)采用親魚孵化。魚眼的變化是受精卵發(fā)育程度的判斷指標(biāo)。孵出前1 d發(fā)育較好的胚胎眼睛呈亮銀色，水流波動(dòng)下可觀察到明顯的反光。當(dāng)70%以上魚眼呈亮銀色反光時(shí)，即仔魚將孵出。小丑魚通常在“日落”后1 h內(nèi)孵出，當(dāng)天日落前將附卵的魚巢帶水取出，轉(zhuǎn)入新魚缸[37]。新魚缸不可開啟循環(huán)，應(yīng)適當(dāng)換水，控制水溫、光照在合適的范圍內(nèi)。孵化缸也可采用親魚缸中的水，以便控制水質(zhì)參數(shù)。在胚胎附近調(diào)節(jié)氣石或氣管閥門微量充氣，模擬親魚胸鰭扇動(dòng)水流作用，防止局部缺氧。充氣不足胚胎會(huì)大批變白壞死；氣泡太大，會(huì)傷害仔魚。人工孵化時(shí)應(yīng)避光孵化，即減少或避免魚卵接觸光照，使仔魚盡可能在完全黑暗的條件下孵出。孵化持續(xù)約30 min，30～60 min后，微光下觀察魚卵的孵出情況[36]。仔魚孵出后，可直接用孵化缸飼養(yǎng)，避免人為轉(zhuǎn)移的機(jī)械損傷。孵化完畢時(shí)幼魚卵黃已所剩無幾，可去除遮光物，添加小球藻和小球藻強(qiáng)化的輪蟲，輪蟲的密度為10個(gè)/L。

4 小 結(jié)

目前對小丑魚性別分化機(jī)制已進(jìn)行了廣泛的研究，近年又運(yùn)用了超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)合分子生物學(xué)方法，試圖從解剖學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和行為生態(tài)學(xué)等多角度闡明小丑魚性別分化的機(jī)理，但尚有許多問題，如在性別分化過程中精巢如何退化，卵巢如何被激發(fā)，哪種特定激素在卵巢分化和精巢組織在卵巢中分化中起關(guān)鍵作用，這些激素又如何被觸發(fā)等等，有待于進(jìn)一步研究。但是，溫度影響小丑魚繁殖周期及其胚胎發(fā)育的時(shí)間。大量的觀測數(shù)據(jù)和研究表明，到本世紀(jì)末，地球氣溫預(yù)測將升高2～4 ℃，海水溫度也將上升約70% (約1～3 ℃)[53-54]。珊瑚礁魚類的早期生活階段對溫度變化尤為敏感，溫度升高的范圍超過其最適溫度，將會(huì)影響仔魚成活率、游泳能力、生長速率及呼吸速率等[54-55]。珊瑚礁魚類成魚對水溫的變化也很敏感，特別是性腺成熟和產(chǎn)卵，對水溫的要求范圍很窄。因此，筆者認(rèn)為有必要針對溫度的升高對小丑魚早期生活階段仔稚魚的生長和發(fā)育及親魚的繁殖周期和產(chǎn)卵行為的影響開展相關(guān)的研究工作。