烏克蘭鱗鯉精子超低溫冷凍保存方法研究

馬 林，李 楠，郝 爽，吳會民，姜巨峰，劉克明，白曉慧，劉肖蓮，李春艷，尤宏爭

( 天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221 )

魚類精子超低溫冷凍保存在遺傳育種、種質(zhì)資源保護以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中均有重大意義。此項技術(shù)的應用可以為魚類種質(zhì)資源的長期保存提供低溫生物學手段；可以有效地解決魚類雌雄發(fā)育不同步或地理間隔的問題；還可以為魚類遺傳學研究不間斷地提供配子材料[1]。多年來，國內(nèi)外諸多學者在魚類精子超低溫冷凍保存方面做了大量研究，并取得較大進展[2-4]。然而，由于不同魚類精子的生物學特征不同，導致冷凍保存的主要實施方法也不盡相同[5]。

烏克蘭鱗鯉(Cyprinuscarpio)，俗稱俄羅斯鯉，屬鯉形目、鯉科、鯉亞科、鯉屬的一個經(jīng)綜合選育的養(yǎng)殖品種，于1998年由全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站自俄羅斯引進[6]。該品種較普通鯉魚具有生長快、個體大、抗病力強、耐低氧、易馴化、易起捕、耐鹽堿性強、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點[7-8]，成為天津市重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。目前，對其研究主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)[9]和規(guī)?；B(yǎng)殖[10]方面，關(guān)于其精子超低溫冷凍保存尚未見報道?；诖?，本試驗采用“三步冷凍法”，對烏克蘭鱗鯉精子進行超低溫冷凍保存試驗，旨在探索出適用于其精子簡便有效的超低溫冷凍保存方法，以期為該種優(yōu)良種質(zhì)資源的保護以及開展其他魚類精子超低溫冷凍保存提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 烏克蘭鱗鯉精液的采集

試驗魚為天津市凱潤水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司飼養(yǎng)的2齡烏克蘭鱗鯉。于2018年5月選取3尾性腺發(fā)育成熟的雄魚進行精液采集。采集過程中，先將親魚撈出，用吸水紙將魚體表面，特別是泄殖孔附近的水分吸干，輕輕擠壓腹部，采集精液于干燥的小玻璃瓶中，采集過程中應注意采集未經(jīng)尿液、糞便污染的精液。采集后，將存儲容器置于冰袋上并避免光線直射，使用養(yǎng)殖用水進行稀釋并激活，顯微鏡鏡檢，活力高于90%進行后續(xù)試驗。

1.2 冷凍主要儀器

冷凍裝置包括2個簡易泡沫船(每個厚度4 cm)和泡沫盒，0.25 mL藍色和白色冷凍麥細管(法國卡蘇)，凍存管(拇指管)，鋁制支撐條(Nalyene)、液氮溫度監(jiān)測探頭(JRI SPYRF)和液氮罐(YDS)。將拇指管與鋁制支撐條用透明扎帶固定，標號后放入液氮壺中并放入液氮罐中，方便后續(xù)使用。解凍使用控溫水浴鍋(DZKW-4)。

1.3 試驗方法

1.3.1 精子活力評價

由精子被激活后運動速度快、路線無規(guī)則，到精子運動明顯減慢、運動軌跡清晰可辨的過程，稱為激烈運動；精子由激活到視野中90%的精子停止運動或原地震顫的過程，稱為精子壽命[11]。精子活力用激活率進行評價，即視野內(nèi)活動精子占精子總數(shù)的百分比。具體操作方法：在干凈的細胞計數(shù)板滴加一滴養(yǎng)殖用水，用一次性注射器針尖沾取少量精液與水滴混勻，迅速在顯微鏡下觀察精子運動情況。為減小誤差，活力檢測由一人完成，由第二個人進行結(jié)果校正。

1.3.2 稀釋液和稀釋比例的篩選

試驗中選取3種稀釋液，為Hank′s稀釋液(8.01 g/L NaCl，0.4g/L KCl，0.14 g/L CaCl2·2H2O，0.35 g/L NaHCO3，0.06 g/L KH2PO4，0.1 g/L MgCl·6H2O，0.1 g/L MgSO4·7H2O，0.06 g/L Na2HPO4·2H2O，10 g/L 葡萄糖，pH=6.8)[12]、Cortland稀釋液(7.25 g/L NaCl，0.38 g/L KCl，0.18 g/L CaCl2·2H2O，1 g/L NaHCO3，0.23 g/L MgSO4·7H2O，0.41 g/L NaH2PO4·H2O，1 g/L 葡萄糖，pH=7)[12]和法國卡蘇公司FreezeFish凍精稀釋液(商品稀釋液)。使用2 mL離心管將精液與稀釋液分別以1∶1、1∶3和1∶5 (體積比)的比例混合，至4 ℃冰箱內(nèi)保存1 h后，顯微鏡檢查精子活力，每種比例3個樣品，每個樣品重復3次，篩選出適宜的稀釋液和稀釋比例。

1.3.3 抗凍劑的篩選

試驗中選取3種抗凍劑，分別為二甲基亞砜、1,2-丙二醇和丙三醇(甘油)。使用20 mL小玻璃瓶，將篩選出用于后續(xù)試驗的Hank′s和FreezeFish稀釋液分別與3種抗凍劑按比例(抗凍劑體積分數(shù)為10%)混合配置冷凍保護液6種(Hank′s+二甲基亞砜，Hank′s+丙二醇，Hank′s+丙三醇， FreezeFish+二甲基亞砜，F(xiàn)reezeFish+丙二醇，F(xiàn)reezeFish+丙三醇)，玻璃瓶蓋上塑料蓋后至4 ℃冰箱內(nèi)預冷。試驗時，使用2 mL離心管，移液槍吸取精液以1∶3和1∶5的比例分別與Hank′s保護液和FreezeFish保護液混合，至4 ℃冰箱保存，逐日鏡檢并記錄精子活力，每組3個樣品，每樣重復3次，篩選適合的保護液配方。

1.3.4 降溫方法與速率的篩選

使用液氮監(jiān)測探頭監(jiān)測并記錄液氮在液氮罐及倒出后的真實溫度。篩選平衡時間的具體操作為：泡沫盒內(nèi)倒入2 L液氮，將監(jiān)測探頭平行置于泡沫船最上方，分別監(jiān)測泡沫船距液氮液面4、8 cm時液氮蒸氣的溫度變化情況，每分鐘記錄實時溫度，篩選適宜的降溫速率。運用“3步冷凍法”，按照過程凍精，經(jīng)24 h冷凍保存，解凍后顯微鏡檢查精子活力，每種降溫方法5個樣品，每樣品重復3次，篩選最適降溫速率(表1)。

表1 降溫步驟

1.3.5 冷凍保存

在冰袋上方放置塑料離心管架，按照篩選出的冷凍方案配置精液與保護劑混合液盛放于2 mL離心管。迅速使用冷凍麥細管吸取混合液，按照上述3種降溫方法，降溫后放入之前準備好的拇指管中(已裝有液氮)，最后放入液氮罐(裝有液氮)中，冷凍保存24 h。

1.3.6 解凍溫度的篩選

選取3種水浴解凍溫度，分別為20、30 ℃和40 ℃。在20 ℃時解凍15 s，30 ℃解凍10 s，40 ℃解凍5 s，水浴后將樣品置于室溫下至解凍完全。將冷凍保存24 h后的樣品完全解凍后，剪去冷凍麥細管封口端，使精液混合液自然流入離心管中，迅速鏡檢，記錄精子活力(%)和精子壽命(s)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，對測定結(jié)果進行單因素方差分析，差異顯著(P<0.05)時，進行Duncan多范圍檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同稀釋液和稀釋比例對精子活力的影響

試驗中使用Hank′s、Cortland和卡蘇FreezeFish凍精稀釋液分別以3種比例對烏克蘭鱗鯉精子進行低溫保存，經(jīng)方差分析檢驗，9種方案的每個試驗組之間差異顯著，并對以上數(shù)據(jù)進行Duncan多范圍檢驗。試驗結(jié)果表明，以Cortland為稀釋液的保存效果最差(P<0.05)。在Hank′s和FreezeFish稀釋液的比較中，除Hank′s稀釋液1∶1組與FreezeFish稀釋液各比例組差異顯著(P<0.05)外，其余各組之間均無顯著差異(P>0.05)。Hank′s稀釋液1∶3組[精子活力(81.5±9.14)%]和FreezeFish稀釋液1∶5組[精子活力(76.5±6.69)%]保存效果較好，用于后續(xù)試驗(圖1)。

2.2 抗凍劑對精子活力的影響

烏克蘭鱗鯉精液在不同種類保護液保存的結(jié)果反映出抗凍劑對精子活力的影響。由表2可見，鯉精液在Hank′s稀釋液與二甲基亞砜組成的保護液(精∶液=1∶3)中保存效果最好，低溫保存2 h后，精子活力較其他組高，達到(79.3±1.2)%，顯著高于其他各組(P<0.05)。保存3 d后，精子活力依然可達35%以上，除略高于使用FreezeFish稀釋液與丙二醇組成的保護液(精∶液=1∶5)，顯著高于其他各組(P<0.05)。選擇此方案用于后續(xù)冷凍試驗。

圖1 稀釋液及稀釋比例對精子活力的影響不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同.

表2 冷凍保護液對精子低溫保存活力的影響

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05).

2.3 降溫方法的篩選

使用液氮監(jiān)測探頭分別監(jiān)測距液氮液面4 cm和8 cm處液氮蒸汽每分鐘的實時溫度，構(gòu)成降溫趨勢圖。由圖2可見，溫度均先后經(jīng)歷快速下降、平穩(wěn)下降和平衡3個階段。在距液面8 cm處，溫度在2 min內(nèi)快速下降到約-15 ℃，隨后緩慢下降并最終平衡于約-20 ℃。在距液面4 cm處，溫度可在2 min內(nèi)快速下降至-58.8 ℃，隨后緩慢下降，在15 min后可平穩(wěn)在約-90 ℃。

圖2 液氮蒸氣降溫趨勢

按照設(shè)計的3種“3步冷凍法”，依照2.2中所篩選的冷凍保護液方案，對烏克蘭鱗鯉精子進行超低溫冷凍保存24 h(圖3)。解凍后，3種方法冷凍后的精子活力差異顯著(P<0.05)。方法2冷凍精子解凍后精子活力最低，為(25.0±4.6)%，顯著低于方法3冷凍精子解凍后活力[(68.5±5.4)%]。

圖3 3種冷凍方法對精子活力的影響

2.4 解凍溫度對精子活力的影響

經(jīng)24 h冷凍保存后，使用恒溫水浴鍋分別設(shè)置解凍溫度為20、30 ℃和40 ℃，對凍精進行解凍。結(jié)果顯示，20 ℃解凍后精子活力顯著低于其他兩組(P<0.05)，30 ℃和40 ℃解凍精子活力無顯著的差異(P>0.05)，但顯著低于對照組(新鮮精子)精子活力(P<0.05)。使用30 ℃解凍后精子活力[(68.2±5.4)%]最高，因此選擇30 ℃作為最適解凍溫度。

圖4 不同解凍溫度對精子活力的影響

3 討 論

3.1 稀釋液

魚類精液在排出體外之后，由于環(huán)境的變化、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的累積等因素，導致精子的活性和存活時間會快速降低直至死亡[12]。添加適宜的稀釋液可以延長精子在體外的存活時間，維持其良好的生理狀態(tài)，以更好地抵抗降溫過程中自由基的不利影響、脂質(zhì)過氧化和細胞膜完整性的破壞[2,13]。魚類精液冷凍保存稀釋液的組成和配比至今沒有一個統(tǒng)一的配方或標準[14]。在稀釋液的選擇上，一般遵循以下原則：(1)稀釋液應與精液等滲或稍高滲以抑制精子運動；(2)有一定的緩沖能力；(3)含有一定的營養(yǎng)物質(zhì)以提供精子微弱代謝的需要；(4)其成分在合適的范圍內(nèi)越簡單越好[1,15-16]。在本試驗中，篩選使用標準Hank′s稀釋液，當精液與Hank′s稀釋液體積比為1∶3時，烏克蘭鱗鯉精子低溫和超低溫保存效果最好，活力分別為(81.5±9.14)%和(68.2±5.4)%。陳雄芳[17]在大黃魚(Pseudosciaenacrocea)精液冷凍保存研究中使用Hank′s獲得了(89.7±7.5)%的凍精成活率；王小剛等[12]證明，點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)精子冷凍保存的最適稀釋液為Hank′s，凍精成活率高于60%。以上研究與本試驗結(jié)果一致。Cortland稀釋液的使用雖然在本試驗中效果不佳，但在黑鯛(Sparusmacrocephalus)[18]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[19]、真鯛(Pagrosomusmajor)[20]等精子超低溫冷凍保存中都獲得了很好的保存效果。FreezeFish稀釋液為一款進口魚類通用稀釋液，其成分未知且未見其他報道，在烏克蘭鱗鯉精液與FreezeFish之比為1∶5時，精子活力同樣處于較高水平，但低于使用Hank′s稀釋液時的精子活力。對此款稀釋液的有效使用有待在開展其他魚類精子冷凍或深入探討最適稀釋比例中進一步研究。

3.2 抗凍劑

冷凍處理會導致精子膜破損，使精子蛋白質(zhì)和線粒體上谷草轉(zhuǎn)氨酶大量逸失進入精漿中，導致精子死亡[1]?？箖鰟┑奶砑幽軌蛟诰拥睦鋬鲞^程中保護精子，使精子細胞降低冰晶損傷，調(diào)節(jié)精子滲透壓，但同時其具有毒性[21]。常用的抗凍劑有二甲基亞砜、1,2-丙二醇、已二醇、丙三醇(甘油)、乙酰胺等，這些滲透性抗凍劑是一類含有羥基的小分子化合物，當與精子混合后能快速通過細胞膜進入到細胞內(nèi)替代部分游離水，降低細胞內(nèi)溶質(zhì)的含量；同時在冷凍時，可以降低溶液的冰點，從而減緩細胞的褶皺程度和脫水速度，減少危險溫度的范圍[4,15-16,22]。本試驗中篩選使用二甲基亞砜、1,2-丙二醇和丙三醇作為抗凍劑，選取體積分數(shù)為10%。試驗中，將精液與以Hank′s和10%二甲基亞砜配置的冷凍保護液以1∶3比例凍存后的精子活力最高，達到(68.2±5.4)%。這也證明了二甲基亞砜是較好的淡水魚精子抗凍劑，而且10%的二甲基亞砜是一個高度有效的體積分數(shù)，既能起到良好的抗凍作用，又不會導致精子中毒[15,23-24]。

3.3 冷凍速度

冷凍速度對于維持精子生理狀態(tài)非常重要，冷凍速度過快，細胞內(nèi)水分不能及時滲出，會導致細胞內(nèi)冰晶的形成，極易刺破細胞膜和細胞器；而冷凍速度過慢會導致精子長時間處于高滲環(huán)境中，易產(chǎn)生滲透休克[3]。本試驗中使用液氮監(jiān)測探頭分別測試距液氮液面4 cm和8 cm處液氮蒸汽每分鐘的實時溫度。在使用方法3時，凍后精子活力最高，方法1的冷凍效果不佳。這可能是由于生物細胞一般比較容易凍結(jié)，特別是0～-60 ℃是細胞冷凍損傷的主要溫度區(qū)間[16,21,25]。使用方法2冷凍精子活力最差，這可能是由于降溫速率過快，且抗凍劑含量過低。低含量的抗凍劑無法使細胞脫水并取代細胞內(nèi)的水，冰晶的形成對細胞造成了不可逆損傷[21-22]。

3.4 解凍溫度

解凍是使冰態(tài)的精子升溫復蘇的過程。在解凍時，細胞外冰會先融化，此時細胞外濃度比細胞內(nèi)低，水分會快速進入到細胞內(nèi)，使得細胞腫脹，當腫脹程度超過細胞自身承受能力時，會造成細胞腫脹性破裂[26]。此外，在解凍過程中容易造成再結(jié)晶，使得細胞膜和細胞器受到損傷[2,13,27-28]。理論上快速解凍有利于精子迅速通過冰晶形成區(qū)，降低冰晶損傷。通常的解凍復蘇方法是30～40 ℃水浴解凍或者室溫流水解凍等[29]。在本研究中，使用30 ℃和40 ℃解凍約10 s后精子活力差異不顯著，且30 ℃的精子活力稍高。但林丹軍等[30]研究表明，對大黃魚凍精使用38～40 ℃的水浴解凍，精子活力低于室溫(21～23.5 ℃)自然解凍；而Irawan等[5]在解凍鯉魚凍精時，使用70 ℃解凍5 s后的精子活力最高可達(94.5±3.3)%。

3.5 精子損傷

精子質(zhì)膜及膜性細胞器對外界環(huán)境變化十分敏感，在外部環(huán)境突變時極易受到損傷[31]。本研究中，經(jīng)過冷凍保存后精子活力較鮮精活力下降近30%，說明精子在冷凍過程中發(fā)生了一定程度的損傷，其生理功能受到影響。使用電鏡觀察鯉魚凍精形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷主要表現(xiàn)為精子頭部脹大，表面凹凸不平，或頭部膨大呈泡狀，嚴重者頭部外膜破裂導致內(nèi)含物外溢，精子尾部外膜破裂，或尾部斷裂缺損等[32]。除細胞膜性結(jié)構(gòu)損傷外，精子核DNA損傷也會造成精子生理功能及受精能力的喪失[33]。金春華等[33]使用單細胞凝膠電泳法對黃姑魚(Nibeaalbiflora)精子DNA進行損傷檢測，根據(jù)彗星拖尾中DNA占細胞總DNA的比例，將凍精核DNA損傷程度分為5級，并分析出隨著精子核DNA損傷的加重，精子核逐漸縮小直至模糊或消失，彗尾逐漸出現(xiàn)至彗尾明顯延長。

4 結(jié) 論

本研究通過篩選不同的稀釋液與稀釋比例、抗凍劑種類、降溫速度與解凍溫度，確立了適用于烏克蘭鱗鯉精子的超低溫冷凍方法，此方法操作簡單、成本低廉，在其種質(zhì)保護方面具有重要意義。在后續(xù)的研究中，可進一步對稀釋液的種類及配方、冷凍速率以及冷凍損傷方面進行深入研究，以進一步提高冷凍精子成活率。