雙菌株聯(lián)合發(fā)酵提高鷹嘴豆納豆激酶活力的研究

郭晨 汪曉鴿 孔少華 尚紫博 樊一 呂成狀 黃裔翔 張俊杰

摘要：以鷹嘴豆為原料，選取兩株不同來源的納豆芽孢桿菌F＼|2＼|4和S＼|15，分別通過單接種和混合接種的方式，制備鷹嘴豆納豆，并測定其納豆激酶活力，結(jié)果表明：通過混合接種方式制備的鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力明顯高于單接種方式，當F＼|2＼|4與S＼|15接種體積比為1GA6FA1，且接種量為4%時，鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力達到最高值6 287.16 UI/g.

Abstract：With chickpea as material，two Bacillus subtilisnatto strains （F＼|2＼|4 and S＼|15） isolated from different sources were selected and were inoculated into chickpea to prepare chickpea natto products by single＼|inoculation and co＼|inoculation，then nattokinase activity of chickpea natto was determined.Results showed that nattokinase activity was improved significantly by co＼|inoculation.When the inoculative volume ratio of F＼|2＼|4 and S＼|15 was 1GA6FA1，and inoculation amount was 4%，the nattokinase activity of chickpea natto reached the maximum 6 287.16 UI/g.

關(guān)鍵詞：雙菌發(fā)酵;鷹嘴豆;納豆芽孢桿菌;納豆激酶

Key words：two strains fermenta＼|tion;chickpea;Bacillus subtilisnatto;nattokinase

中圖分類號：TS214.9文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.04.003

文章編號：2096-1553（2019）04-0015-06

0 引言

傳統(tǒng)納豆是以大豆為原料，接種納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisnatto）后，在一定條件下通過發(fā)酵而制成的一種豆類食品[1].成熟的納豆呈深黃色，有光澤，口感松軟，表面黏液明顯，用筷子挑起可以拉起很長的黏液絲狀物質(zhì)，口感微甜，有淡淡氨臭味[2].納豆營養(yǎng)價值很高，具有抗血栓、降血壓、抗腫瘤等多種生理功能，長期食用可預(yù)防或治療多種亞健康疾病[3].納豆激酶是一種具有強大溶栓活性的絲氨酸蛋白酶[4]，與臨床一線溶栓藥物（尿激酶和鏈激酶） 相比，納豆激酶具有安全性好、成本低、半衰期長、可口服等優(yōu)點，因此作為溶栓藥物或保健食品備受關(guān)注[5].

盡管納豆是一種成本低、營養(yǎng)價值高的健康食品，但因其具有特殊氨臭味，不易被廣大消費者接受[6].

鷹嘴豆是僅次于大豆的世界第二大種植豆類[7]，所含氨基酸種類齊全，且包含了人體必需的8種氨基酸[8].

金爽等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后，具有比傳統(tǒng)納豆氨臭味輕、拉絲現(xiàn)象少、口感好、納豆激酶活性高等優(yōu)點.

因此，用鷹嘴豆發(fā)酵制作納豆具有廣闊的開發(fā)前景.

納豆芽孢桿菌是可應(yīng)用于食品的安全益生菌，具有改善人體腸道菌群，助消化，增強肌體免疫力等功能[10].將納豆芽孢桿菌接種到鷹嘴豆上進行發(fā)酵，可制成富含納豆激酶的鷹嘴豆納豆.納豆激酶活力是評價納豆品質(zhì)和營養(yǎng)價值的重要指標，其評價方法很多，主要包括纖維蛋白平板法、纖維蛋白塊溶解時間法、四肽底物法、酶聯(lián)免疫吸附法、血清板法和Folin-酚法等[11].其中，F(xiàn)olin-酚法簡單易行、成本低，可以同時測定多個樣品，且采用此法測得的納豆激酶活力與纖溶活力之間存在一定的相關(guān)性[12].

張俊杰等[13]分別從市購納豆和土壤中分離出納豆芽孢桿菌，用其發(fā)酵制備鷹嘴豆納豆，并采用Folin-酚法測定了鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力.高瑞雄等[10]用分離自市購納豆中的納豆芽孢桿菌

菌株發(fā)酵得到的納豆中，納豆激酶活力更高;從土壤中分離出的納豆芽孢桿菌菌株，在發(fā)酵鷹嘴豆納豆產(chǎn)納豆激酶方面也有著接近于市購納豆中分離出的納豆芽孢桿菌菌株的優(yōu)良性能.此外，接種方式和接種量對納豆芽孢桿菌的生長狀態(tài)具有重要影響，進而影響其發(fā)酵過程[14].王瑞珍等[15]用納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合接種發(fā)酵核桃粕，納豆激酶活力提高了70.42%.孫軍德等[16]采用沼澤紅假單胞菌和納豆芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵淀粉豆，納豆激酶活力提高了53.74%.

張超鳳等[17]在運用響應(yīng)面法優(yōu)化納豆激酶液態(tài)發(fā)酵條件時發(fā)現(xiàn)，隨著納豆芽孢桿菌接種量的增加，納豆激酶活力也在提高，當納豆芽孢桿菌接種量為2%時，納豆激酶活力最高，而當納豆芽孢桿菌接種量超過2%時，納豆激酶活力急劇下降.

基于此，本研究擬以鷹嘴豆為原料，從分離自市購納豆和土壤的納豆芽孢桿菌中各挑選一株高產(chǎn)納豆激酶菌株，同時設(shè)置不同的接種量梯度，并分別采用單接種和混合接種兩種方式制備鷹嘴豆納豆，以納豆激酶活力為響應(yīng)指標，研究最佳接種量和接種體積比，以期制得具有高納豆激酶活力的鷹嘴豆納豆.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 鷹嘴豆，購自云南文山自治州丘北縣;納豆芽孢桿菌菌株F|2|4和S|15，分別分離自市購納豆和土壤，現(xiàn)保存于鄭州輕工業(yè)大學423實驗室菌庫（WYCCWF）.

1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑 LB固體培養(yǎng)基和胰蛋白胨（生化試劑），北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn);Folin-酚試劑（分析純），北京索萊寶科技有限公司產(chǎn);酵母浸粉（生化試劑），北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠產(chǎn);L-酪氨酸（分析純），合肥博美生物科技責任有限公司產(chǎn);HCl，NaCl，Na2HPO4，KH2PO4，Na2CO3，MgSO4等化學試劑（分析純），天津市永大化學試劑有限公司產(chǎn).

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 DH-600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、

101型電熱鼓風干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn);SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn);DMEX30型生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司產(chǎn);BCD-221TMBA型冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn);FORMA-86C型超低溫冰箱，鄭州金友寧儀器有限公司產(chǎn);ZWY-100H型搖床，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn);AE224型分析天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn);TGL-16G型離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn);SC-15型恒溫水浴鍋和SCIENTZ-10N型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn);T6型紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn).

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化

從-80 ℃冰箱中取出篩選保存的供試納豆芽孢桿菌菌株F|2|4和S|15甘油管，

待甘油管在室溫下融化后，在超凈工作臺內(nèi)吸取100 μL菌液，采用劃線平板法均勻涂在LB平板上，于37 ℃條件下倒置培養(yǎng).待菌落長出后，挑取單菌落接種于50 mL液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，備用.

1.2.2 鷹嘴豆納豆的制備 鷹嘴豆納豆的制備工藝流程為：

原料預(yù)處理→蒸煮→接種→發(fā)酵→后熟.具體制作步驟如下.

1）原料預(yù)處理：挑選顆粒飽滿、大小均勻的鷹嘴豆，清水淋洗去除鷹嘴豆中的雜質(zhì)，于室溫下清水浸泡24 h.

2）蒸煮：將浸泡后的鷹嘴豆在0.13 MPa壓力下蒸煮20 min.

3）接種：于無菌條件下按設(shè)定的接種量和接種體積比接種納豆芽孢桿菌.接種后輕輕晃動三角瓶，使鷹嘴豆與菌液充分接觸.

4）發(fā)酵：于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)24 h.

5）后熟：發(fā)酵結(jié)束后，置于4 ℃條件下后熟24 h[13]，即得鷹嘴豆納豆.

1.2.3 單接種實驗

將F|2|4和S|15兩株菌的菌液分別以V（單菌株）GA6FAm（鷹嘴豆）=2%，4%，6%，8%，10%的接種量接種到滅菌蒸熟的鷹嘴豆中，采用1.2.2中的發(fā)酵條件制備鷹嘴豆納豆，然后測定各樣品納豆激酶活力.

1.2.4 混合接種實驗

將F|2|4和S|15兩株菌的菌液分別以1GA6FA3，1GA6FA2，1GA6FA1，2GA6FA1，3GA6FA1 的體積比混合后，以V（混合菌株）GA6FAm（鷹嘴豆）=2%，4%，6%，8%，10%的接種量分別接種到滅菌蒸熟的鷹嘴豆中，采用1.2.2中的發(fā)酵條件制備鷹嘴豆納豆，同時測定各樣品納豆激酶活力.

1.2.5 納豆激酶粗酶液的制備

將發(fā)酵好的新鮮納豆送入預(yù)冷室冷凍至-35～-40 ℃，然后進行冷凍干燥，最后用粉碎機粉碎即得含納豆激酶的納豆樣品粉末.在每g納豆樣品粉末中加入5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.9%的生理鹽水，于4 ℃條件下浸提4 h，再于4 ℃條件下 4500 r/min 離心20 min，所得上清液即為納豆激酶粗酶液[17].

1.2.6 酪氨酸標準曲線的繪制

按照表1所示Folin-酚法試劑表依次加入Tyr標準溶液、蒸餾水和試劑A，混勻，室溫放置10 min，再加入試劑B，立即混勻，室溫放置30 min，以0#管作為空白對照調(diào)0，于 680 nm波長處測定其他各管OD值，然后以酪氨酸（Tyr）標準溶液質(zhì)量濃度/（μg·mL-1）為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制酪氨酸標準曲線.

1.2.7 納豆激酶粗酶液OD值的測定

參考標準SB/T 10317—1999[18]的方法，在1.5 mL離心管中加入300 μL納豆激酶粗酶液，再加入300 μL質(zhì)量分數(shù)為1%的酪蛋白溶液，混勻，40 ℃ 水浴加熱10 min，再加入300 μL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng).于室溫條件下4500 r/min離心10 min.取上清濾液 20 μL，用上述Folin-酚法測定680 nm波長處的納豆激酶粗酶液OD值.

1.2.8 納豆激酶活力計算方法

在40 ℃條件下，每g樣品每min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即被定義為1個蛋白酶活力單位.樣品納豆激酶活力計算公式如下.

樣品納豆激酶活力=A10M×45N

式中：A為由樣品測得的OD值，帶入標準曲線得相應(yīng)的酪氨酸質(zhì)量/μg;10表示反應(yīng)時間 10 min;M為樣品質(zhì)量/g;45表示從900 μL反應(yīng)液中取出20 μL進行測定，即45倍;N為酶液稀釋的倍數(shù).

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.1進行數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線的繪制與分析

圖1為用Folin-酚法繪制的酪氨酸標準曲線，得到的標準曲線回歸方程為y=0.056 5x+0.003，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，表明兩者之間線性關(guān)系良好，能夠用于樣品納豆激酶活力的測定.

2.2 單接種對納豆激酶活力的影響

圖2為單接種對納豆激酶活力的影響結(jié)果.從圖2可以看出，采用單一菌株發(fā)酵制備的鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力較低，均在3000 UI/g以下，且納豆激酶活力均呈現(xiàn)出隨著接種量的增加先升高后降低的趨勢.其中，F(xiàn)|2|4 菌株在接種量為4%時納豆激酶活力最高，達2 827.09 UI/g，顯著高于S|15菌株的1 443.99 UI/g;而S|15菌株在接種量為6%時納豆激酶活力最高，為2 017.78 UI/g，與接種F|2|4菌株的2 032.79 UI/g無顯著差異.這可能是因為隨著接種量增加，納豆芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量代謝產(chǎn)物抑制了其自身生長，從而使發(fā)酵后期的納豆激酶活力有所降低.

2.3 混合接種對納豆激酶活力的影響

圖3為混合接種對納豆激酶活力的影響結(jié)果.從圖3可以看出，經(jīng)混合接種發(fā)酵后，納豆激酶活力顯著提升，均高于5000 UI/g，顯著高于單接種時的納豆激酶活力.當F|2|4菌株與S|15菌株的接種體積比為1GA6FA3，1GA6FA2和3GA6FA1時，在接種量為6%時達到最大值，分別為6 157.16 UI/g，5 793.12 UI/g和5 906.88 UI/g;

且當F|2|4菌株與S|15菌株的接種體積比為1GA6FA3時，納豆激酶活力隨著接種量的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，而當F|2|4菌株與S|15菌株的接種體積比為1GA6FA2和3GA6FA1時，納豆激酶活力在接種量為6%時達到最高值后隨著接種量的增加呈現(xiàn)出一定的波動.當F|2|4菌株與S|15菌株

的接種體積比為1GA6FA1和2GA6FA1時，在接種量為4%時達到最大值，分別為6 287.16 UI/g 和5 626.78 UI/g.而在相同的接種量下，納豆激酶活力均在兩株菌接種體積比為1GA6FA1時達到最高.當接種體積比為1GA6FA1，接種量為4%時，納豆激酶活力為所有接種組合中的最高值，為6 287.16 UI/g.因此，確定當菌株F|2|4與S|15的混合接種體積比為1GA6FA1，接種量為4%時，為兩菌珠混合接種的最優(yōu)接種參數(shù).

3 結(jié)論

本研究采用兩株分離自市售納豆和土壤的納豆芽孢桿菌F|2|4和S|15，分別采用單接種和混合接種兩種方式發(fā)酵鷹嘴豆，制備鷹嘴豆納豆.結(jié)果表明，與單接種相比，F(xiàn)|2|4菌株和 S|15菌株混合接種后，鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力從不到3000 UI/g增加到5000 UI/g以上，有了顯著的提升.當兩菌株接種體積比為1GA6FA1，接種量為4%時，鷹嘴豆納豆中納豆激酶活力最高，達6 287.16 UI/g.這說明在混合接種條件下，兩菌協(xié)同生長可以更好地促進納豆激酶的產(chǎn)生.

該研究的結(jié)果已證明混合接種相較于單接種對提高納豆激酶活力有著明顯的優(yōu)勢，而影響鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力的因素還有很多，比如發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等.

接下來擬進一步研究混合接種其他因素對鷹嘴豆納豆感官品質(zhì)的影響，以便為鷹嘴豆納豆的開發(fā)和推廣提供參考.

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