杠板歸提取物體外抗柯薩奇病毒B3作用機(jī)理初探

雷湘 周峰 陳科力 楊珍

【摘? 要】目的：本文旨在初步研究杠板歸提取物抗病毒作用的機(jī)理。方法：用不同處理方法得到的藥物樣品采用不同的作用方式作用柯薩奇病毒（CVB3）感染的Hep-2細(xì)胞，72h后MTT法測(cè)定細(xì)胞活性;利用體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，加入不同的藥物樣品，檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌的γ-干擾素量的變化，以此判斷杠板歸提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響。結(jié)果：S2樣品具有直接殺死CVB3作用，還可以抑制CVB3病毒的生物合成并且具有明顯的刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素的作用;S1樣品具有一定的直接殺死CVB3作用，但其他作用機(jī)制不明顯。結(jié)論：杠板歸不同提取部位抗病毒效力不同，機(jī)理也不同。S2樣品可以直接殺死病毒，對(duì)于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒，可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力，抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的生物合成來發(fā)揮抗病毒的效力;S1抗病毒作用不強(qiáng)。

【關(guān)鍵詞】杠板歸提取物;抗病毒作用;γ-干擾素;巨噬細(xì)胞;

【中圖分類號(hào)】R47????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A????? 【文章編號(hào)】1672-3783（2019）01-0082-02

杠板歸為一種蓼科一年生草本植物，主要有清熱止咳、散瘀解毒、止痛等作用，廣泛用于治療皰疹，潰瘍，瘧疾，水腫，濕疹，痢疾，百日咳，丹毒，毒蛇咬傷等，療效確切[2-3]。文獻(xiàn)顯示杠板歸具有較好的抗病毒的作用，但是其抗病毒作用的有效成分是什么，抗病毒機(jī)理是什么，亟待解決，我們選擇兩種不同的提取方法獲得的杠板歸提取部位作為實(shí)驗(yàn)藥物樣品進(jìn)行抗病毒研究，以期發(fā)現(xiàn)活性較高的有效部位。科薩奇病毒在人群中感染十分普遍，與多種疾病都有關(guān)系，是病毒性心肌炎的主要病因，能引起心肌細(xì)胞的各種炎癥反應(yīng)，影響心臟功能，目前國(guó)內(nèi)外還沒有有效的治療CVB3藥物，我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)杠板歸提取物具有一定的抗CVB3的作用，但作用有效成分和機(jī)理還未確定。本實(shí)驗(yàn)為后期深入研究其抗病毒作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;XD-30倒置顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）;AG22331HAMBURG高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf有限公司）;RPMI-1640（GIBCO公司）;小牛血清（GIBCO公司）;四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Amresco公司）;Hep-2細(xì)胞，由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病毒研究所保存，細(xì)胞生長(zhǎng)液為含10%小牛血清的RPMI-1640，細(xì)胞維持液為含2%小牛血清的RPMI-1640;CVB3（Nancy株），由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒所保存。病毒經(jīng)Hep-2細(xì)胞活化增殖，細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲，反復(fù)凍融3次，3000rpm離心30min，上清液分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。在Hep-2細(xì)胞上測(cè)定其TCID50為10-5。實(shí)驗(yàn)中使用的感染劑量為100TCID50;IFN-γ試劑盒（QuantoBio 公司）;KM種小鼠，雄性，體重（20±2）g，購于湖北省疾病控制中心。

2 方法

2.1藥物樣品制備? 杠板歸提取物由湖北中醫(yī)學(xué)院中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，樣品S1、S2分別為不同處理方法得到的不同提取部位的干燥粉末。具體提取方法如下：將杠板歸切小段，10倍體積水煮3次，合并水液，濃縮成相當(dāng)于0.5～1g×ml-1原藥材的原液。用70%乙醇沉淀，取上清液回收乙醇，干燥，保存，作為S1樣品;上述扛板歸水提取醇沉淀后的沉淀干燥，保存作為S2樣品。

2.2藥物樣品對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)定? 96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，使其生長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)液，分別加入含有不同濃度藥物樣品的細(xì)胞維持液，使每組藥物終濃度分別為1、2、4、8、16、32mg·mL-1，37℃，5%CO2培養(yǎng)，每12h觀察一次細(xì)胞形態(tài)，并以正常細(xì)胞作對(duì)照，72h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，計(jì)算出藥物對(duì)細(xì)胞的TC50。每一藥物濃度均重復(fù)4孔。

2.3藥物樣品體外抗柯薩奇病毒試驗(yàn)根據(jù)2.2藥物樣品對(duì)細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在半數(shù)毒性濃度下確定高、中、低3個(gè)濃度梯度，以培養(yǎng)液對(duì)藥物樣品進(jìn)行溶解和稀釋，分別用這三種不同濃度的藥物樣品對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

2.3.1藥物樣品抗病毒吸附組 將含有不同濃度的藥物樣品的培養(yǎng)液0.1ml加入生長(zhǎng)完好的單層Hep-2細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中（每孔細(xì)胞數(shù)目大致相同），37℃，5%CO2孵育1.5h后，棄去含藥培養(yǎng)液，再加入0.1ml病毒液，37℃，5%CO2孵育1.5h后，棄去病毒液，再加入普通細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3.2 藥物樣品對(duì)病毒直接作用組 將含有不同濃度的藥物樣品的培養(yǎng)液0.1ml和病毒液0.1ml混合，37℃，5%CO2孵育1.5h后，再加入到生長(zhǎng)完好的單層Hep-2細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2孵育1.5h后，棄去含藥含病毒培養(yǎng)液，再加入普通細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3.3 藥物樣品抗病毒生物合成組 將0.1ml病毒液加入生長(zhǎng)完好的單層Hep-2細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2孵育1.5h后，棄去病毒液，再加入含有不同濃度的藥物樣品的維持液繼續(xù)培養(yǎng)。

以上三個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過處理后，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)72h～120h，參照正常細(xì)胞對(duì)照組，病毒對(duì)照組，每12h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及相應(yīng)CPE程度，72h～120h細(xì)胞對(duì)照組生長(zhǎng)正常，病毒對(duì)照組出現(xiàn)75%以上典型CPE時(shí)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。

2.3.4細(xì)胞活性測(cè)定和試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 MTT法、細(xì)胞存活率和病毒抑制率的計(jì)算方法

MTT法測(cè)定藥物細(xì)胞毒性：96孔板棄去含藥維持液，每孔加入5%MTT溶液50ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去MTT液，每孔加入100ulDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇570nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的光吸收值。

細(xì)胞存活率= 藥物組平均OD值/細(xì)胞對(duì)照組平均OD值×100%;

病毒抑制率=（藥物組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值）/（正常細(xì)胞對(duì)照組OD值-病毒對(duì)照組OD值）×100%;

半數(shù)細(xì)胞毒性濃度TC50為使藥物組OD值比正常細(xì)胞對(duì)照組降低50%的藥物濃度;

半數(shù)病毒抑制濃度IC50為保護(hù)50%的細(xì)胞免受病毒破壞的藥物組濃度。

用 SPSS 11. 5軟件來計(jì)算。采用治療指 數(shù)（TI） 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來衡量藥物對(duì)病毒的抑制 效力。TI= TC50/IC50 。TI值越大，藥物抑制病毒的作用越強(qiáng)。

2.4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 3d前向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌的液體石蠟1ml，引頸處死小鼠，消毒后置于無菌操作臺(tái)內(nèi)，剪開腹部，暴露出腹膜，用少許70%酒精輕擦腹膜壁后，注入5mlPBS液，然后用針頭輕輕挑起腹壁，吸出腹液置于離心管中，1000rpm4℃離心10min，去上清，加入含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)2h后，棄去培養(yǎng)液，然后加入20%培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)24h后消化細(xì)胞，離心去上清，用PBS洗兩次，將制備好的巨噬細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，并使每孔的細(xì)胞濃度控制在103ml-1中，37℃，5%CO2培養(yǎng)。

2.5將生長(zhǎng)成單層巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，分別加入含不同濃度藥物樣品的維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，每12小時(shí)觀察一次細(xì)胞形態(tài)，并與正常細(xì)胞作對(duì)照，24h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，每一藥物劑量均重復(fù)2孔，計(jì)算TC50。

2.6 藥物樣品對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響根據(jù)2.5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在藥物TC50范圍內(nèi)，確定高、中、低3個(gè)濃度梯度，加入到生長(zhǎng)成單層的巨噬細(xì)胞96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，24h后，用γ-干擾素試劑盒檢測(cè)，在450nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式釋放率%=（樣品OD值-陰性對(duì)照OD值）/陽性對(duì)照OD值×100%，計(jì)算得到藥物樣品的γ-干擾素釋放率（陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均為試劑盒內(nèi)含）。

3 結(jié)果

3.1藥物樣品對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性 不同濃度的藥物作用于Hep-2細(xì)胞72h后，用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。經(jīng)過計(jì)算，得到S1樣品TC50為2.9μg×ml-1，S2樣品 TC50為3.4μg×ml-1。

3.2 藥物樣品抗CVB3病毒的作用

3.2.1藥物樣品抗病毒吸附組 兩種藥物樣品與Hep-2細(xì)胞事先作用1.5h再接種病毒后72h內(nèi)，都沒有顯現(xiàn)出對(duì)感染CVB3的細(xì)胞具有保護(hù)作用，各孔細(xì)胞均出現(xiàn)典型的病毒病變，即CPE癥狀：細(xì)胞生長(zhǎng)紊亂，細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化，變圓或細(xì)長(zhǎng)，顆粒增多，折光性增加，最后脫落死亡，說明CVB3在Hep-2細(xì)胞中的繁殖不受抑制，藥物樣品均無抗病毒吸附作用。

3.2.2 藥物樣品對(duì)病毒直接作用組 藥物和病毒直接作用后再感染Hep-2細(xì)胞，結(jié)果顯示S1、S2均有有一定的直接殺死作用。

3.2.3 藥物樣品抗病毒生物合成組 感染了CVB3病毒的Hep-2細(xì)胞藥物樣品進(jìn)行處理，結(jié)果顯示S2具有比較好的抗病毒生物合成的作用，S1沒有該作用。

3.3藥物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，不同濃度的藥物作用于小鼠巨噬細(xì)胞24h后，用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。經(jīng)過計(jì)算，得到S1TC50為2.7μg×ml-1，S2 TC50為3.0μg×ml-1，

3.4藥物樣品對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響，結(jié)果見圖2。

4 討論

本部分實(shí)驗(yàn)通過柯薩奇病毒感染的Hep-2細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)三種不同提取方法獲得的不同杠板歸提取部位，對(duì)柯薩奇病毒具有不同的抗病毒效果，其中，S1樣品的直接殺死作用較強(qiáng)，達(dá)到了61.6%，S2抑制病毒生物合成的作用較強(qiáng)，達(dá)到了73.4%，而S3基本沒有作用。說明不同提取部位中所含成分不一樣，這對(duì)我們今后研究杠板歸藥物的抗病毒活性部位的篩選提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)第一部分已經(jīng)進(jìn)行了體外抗病毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)杠板歸提取物具有一定的抗病毒作用，特別是S2樣品，能顯著抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的生物合成，但是作用機(jī)理還不能確定，激活免疫細(xì)胞，提高機(jī)體的免疫能力，就是非常重要的一種抗病毒途徑。

病毒感染機(jī)體以后，會(huì)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答，將病毒感染的細(xì)胞處理掉，機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活，其實(shí)就是免疫細(xì)胞的激活，包括巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，T細(xì)胞、B細(xì)胞等等。其中巨噬細(xì)胞起著非常重要的作用，他們吞噬病原體，激活T細(xì)胞，釋放各種細(xì)胞因子。IFN-γ就是巨噬細(xì)胞釋放的一種重要的細(xì)胞因子，發(fā)揮著重要的抗病毒作用。干擾素具有廣譜的抗病毒活性（它對(duì)乙肝病毒DNA及丙肝病毒RNA的復(fù)制有一定抑制作用）、抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)作用，可治療多種腫瘤病毒病，一般病毒病和若干腫瘤等疾病，并且在1982年，γ-干擾素已在E.COLI或者Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）中表達(dá)成功。[12]

本實(shí)驗(yàn)第二部分，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，利用藥物作用巨噬細(xì)胞一段時(shí)間后，測(cè)定巨噬細(xì)胞分泌的γ-干擾素的量是否有變化，以此來研究藥物的抗病毒機(jī)理。本文通過藥物影響巨噬細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素的模型，把杠板歸抗病毒機(jī)理進(jìn)行了初探，對(duì)于對(duì)于研究杠板歸作用機(jī)理具有重要的意義。

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