circRNA在肝細胞癌致病機制中的研究進展

張亞，浦澗

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

在全世界惡性腫瘤中病死率居于第二位的惡性腫瘤——肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟原發(fā)性腫瘤中最常見的類型，尤其在我國最為多見[1]。我國每年有超過300 000人死于肝癌，這對我國國民的身體健康造成了極其嚴重的危害，而且其發(fā)病率仍然呈上升趨勢，這主要是近幾十年來病毒性肝炎、酗酒和肥胖的發(fā)病率增加所致[1-2]。其中導致我國HCC發(fā)生的主要因素為乙型病毒性肝炎后的肝硬化，而西方國家比較常見的因素則是長期大量的飲酒，此外還有含黃曲霉毒素食物的攝入、非酒精性脂肪肝損傷等[3]。雖然近年來已經(jīng)在HCC的診療技術(shù)上取得較大進步，但是傳統(tǒng)的手術(shù)切除仍然是目前延長肝癌患者生存期最有效的治療方法，也是唯一能治愈HCC的方法[4]。但有研究顯示，HCC手術(shù)切除術(shù)后5年復發(fā)轉(zhuǎn)移率可高達60%～70%[5]，大約有50%的患者在手術(shù)切除后5年內(nèi)死亡[6]。大多數(shù)HCC患者處于疾病的早期時不易被發(fā)現(xiàn)，究其原因主要為HCC缺乏特異性的標志物，等到發(fā)現(xiàn)的時候已經(jīng)失去了手術(shù)醫(yī)治的最佳時期，因此HCC患者的治療效果和預后較差[7]。除此之外，HCC的復發(fā)和轉(zhuǎn)移也是影響HCC患者是否能夠得到長期生存的關(guān)鍵要素。

近年來，對原發(fā)性肝癌致病機制的研究，重點涉及了致癌基因、抑癌基因、表觀遺傳學、非編碼RNA等方面，特別是針對環(huán)狀RNA(circRNA)在原發(fā)性肝癌的致病機制研究中，涉及了HCC的干性轉(zhuǎn)變、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、細胞miRNA的表達異常等，并獲得了較大的進展。本文就circRNA在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究部分新進展作一綜述。

1 circRNA概述

circRNA是人類最早于20世紀70年代在病毒中發(fā)現(xiàn)的一類RNA[8]，它獨特的天然封閉式環(huán)狀結(jié)構(gòu)使自身不容易受RNA外切酶的影響而發(fā)生降解，因此自身的表達更加穩(wěn)定[9]。但當時人們的知識水平與技術(shù)條件有限，發(fā)現(xiàn)circRNA是一種不編碼蛋白質(zhì)的RNA，因此認為它沒有生物學功能，只是一種由于剪接錯誤而產(chǎn)生的一類特殊的內(nèi)源性非編碼RNA分子，從而忽略了對它的研究。近些年來隨著高分子通量測序等生物技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的circRNA被證實在很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色[10]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA是共價封閉的環(huán)狀RNA分子，通常來自于外顯子序列，并在正側(cè)剪接位點被剪接而成；circRNA大多數(shù)是來自于基因編碼區(qū)的外顯子，其它circRNA來自于5′-或3′-非翻譯區(qū)(5′- utrs或3′- utrs)、內(nèi)含子和基因間區(qū)，以及反義RNA[11]。因此，circRNA被分為4類：外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA和基因間circRNA。circRNA豐度，甚至是通過選擇性剪接表達的circRNA亞型豐度，都因細胞類型不同而不同；circRNA在大腦中富集，并在胎兒發(fā)育期間大量增加[12]。這些特征的發(fā)現(xiàn)，使得研究人員提出了關(guān)于circRNA的生物合成、在順式和反式中的調(diào)控、功能及其作用機制的基本問題，并成為當今的研究熱點[13]。此外，circRNA在細胞中的運輸和降解也是一個具有挑戰(zhàn)性的未解問題。近幾年來，越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中存在著異常表達，它們的異常表達影響了癌細胞的侵襲和遷移能力，也是癌癥患者轉(zhuǎn)移復發(fā)和死亡的重要原因。但這些發(fā)現(xiàn)只是冰山一角，對于人類來說，成千上萬存在于自然界的circRNA如今仍然是謎一樣的存在。

2 circRNA的作用機制

circRNA近幾年來作為被廣泛研究的對象，它參與了多種惡性腫瘤的細胞增殖、分化、遷移、侵襲和許多信號通路，尤其是與HCC之間的關(guān)聯(lián)已成為當前研究的熱門話題。下面從circRNA在HCC中影響miRNA的表達、調(diào)節(jié)干性轉(zhuǎn)變及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，以及細胞自噬等綜述其致病機制。

2.1 circRNA與miRNA miRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈內(nèi)源性染色體編碼的核苷酸小分子RNA，長度為19～25個核苷酸的小分子RNA，它們通過調(diào)控mRNA翻譯和降解而調(diào)節(jié)抑癌基因和癌基因的表達，控制腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展，在幾乎所有與腫瘤相關(guān)的過程都發(fā)揮著重要作用，對多種腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲以及轉(zhuǎn)移有重要意義[14]。比如，有學者通過實驗研究發(fā)現(xiàn)miRNA-338-3p在癌組織或細胞中的表達較低，而在癌旁組織中的表達明顯要高于癌組織，并且通過實驗證明了miRNA-338-3p與腫瘤細胞的遷移和增殖有關(guān)[15-16]。Salmena L等[17]在2011年首次發(fā)現(xiàn)并證明circRNA主要是作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)，即作為miRNA分子“海綿”來發(fā)揮作用，又被稱為競爭內(nèi)源性RNA機制。ceRNA上存在著多個能夠與miRNA互補結(jié)合位點，自身來充當miRNA的海綿，與miRNA競爭性結(jié)合，從而發(fā)揮對下游靶基因的調(diào)控作用，參與HCC的發(fā)生與發(fā)展[18]。

在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，miRNA在circRNA調(diào)節(jié)肝癌發(fā)生發(fā)展的致病機制中充當?shù)闹匾巧巡糠肢@得闡明，如Yu J等[19]通過實驗證實circRNA-104718通過靶向miR-218-5p/TXNDC5信號通路促進肝癌的進展。circRNA-104718作為ceRNA，通過與硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白5(TXNDC5)mRNA競爭，并直接與miR-218-5p結(jié)合，解除miR-218-5p靶TXNDC5的抑制，從而導致miRNA功能的抑制，促進了細胞的增殖、遷移、侵襲，以及抑制了細胞的凋亡，并且在肝癌組織中過表達的circRNA-104718可以增加腫瘤的體積和轉(zhuǎn)移率。而且，circRNA通過海綿樣作用于miRNA，形成circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來影響肝癌的發(fā)生發(fā)展[20]。如Liu Z等[21]發(fā)現(xiàn)circRNA-5692能通過circRNA-5692/miR-328-5p/DAB2IP通路抑制miR-328-5p，促進DAB2IP表達，從而抑制肝癌的進展。Jiang P等[22]發(fā)現(xiàn)circ_0091579可通過介導miR-940調(diào)節(jié)TACR1的表達來介導HCC的發(fā)展，他們通過注射Huh7細胞建立小鼠異種移植模型，證實敲除circ_0091579可以下調(diào)circ_0091579基因表達來抑制HCC細胞的生長，這可能與其通過ceRNA的機制介導miR-940/TACR1軸降低腫瘤細胞的生長相關(guān)。在乳腺癌中也存在與HCC類似的機制，Xie J等[23]用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)或蛋白印跡法(Western Blot)檢測circ_0061825在乳腺癌(BC)組織和細胞中呈過表達，通過雙熒光素酶報告基因分析確定circ_0061825、miR-593-3p和FGFR3之間的靶向關(guān)系以及動物實驗得出，circ_0061825作為miR-593-3p的分子海綿，可以通過海綿包裹miR-593-3p來調(diào)控FGFR3的表達來調(diào)節(jié)BC惡性進展，除此之外還發(fā)現(xiàn)通過敲低circ_0061825能證實miR-593-3p過表達可通過下調(diào)FGFR3抑制BC細胞的惡性進展。類似的原理在胃癌中也被證明，Yang X等[24]發(fā)現(xiàn)circ_0110805是一種在耐順鉑的胃癌組織和細胞中表達上調(diào)高表達的circRNA，其沉默可以抑制胃癌的發(fā)展，通過海綿miR-299-3p下調(diào)ENDOPDI表達來抑制胃癌細胞對順鉑等化療藥物的耐藥性。

2.2 circRNA與HCC的干性轉(zhuǎn)變 腫瘤干細胞(cancer stem cells/tumor initial cells，CSCs)被認為是惡性腫瘤不易被治療的重要因素之一，它一方面能夠通過自我復制保持其自身的“干性”，另一方面也可以通過分化成為腫瘤細胞，從而促進腫瘤的生長。目前可檢測的腫瘤細胞干性標志物主要有CD133、CD44、CD90、ALDH1、ABCG2、核黃素等，并且已經(jīng)有越來越多的證據(jù)證實circRNA在與CSCs相關(guān)的調(diào)控信號通路中扮演著至關(guān)重要的角色，在這些信號通路中，它們既可以作為癌基因，也可以作為腫瘤抑制因子，而Wnt/β-catenin信號通路則是參與CSCs調(diào)控的關(guān)鍵通路[25]。研究發(fā)現(xiàn)，circ-ABCC1上調(diào)通過CD133-/Caco2或CD133-/HCT15介導促進結(jié)腸直腸癌細胞的干性、集落形成和轉(zhuǎn)移，并證實circ-ABCC1是通過激活Wnt/catenin通路促進結(jié)腸直腸癌進展[26]；Sun J等[27]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001806在結(jié)腸直腸癌組織中顯著上調(diào)，通過激活hsa_circ_0001806/miR-193a-5p/COL1A1軸促進結(jié)腸直腸癌細胞的干性，并與結(jié)腸直腸癌的TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。Zhu YJ等[28]在研究中首次證明circZKSCAN1通過與FMRP競爭性結(jié)合來阻斷CCAR1與FMRP結(jié)合，使Wnt/β-catenin信號通路失活，從而抑制肝癌的細胞干性，誘導腫瘤靜止，并通過抑制癌細胞的干性來抑制多種惡性行為。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，circ-MALAT1通過充當ceRNA，并與miR-6887-3p競爭性結(jié)合，上調(diào)癌基因(JAK2)和增加磷酸化JAK2，增強JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導，從而促進肝CSCs的自我更新，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[29]。

2.3 circRNA與HCC的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是標志惡性腫瘤細胞開始發(fā)生轉(zhuǎn)移以及獲得遷移和侵襲能力的重要過程，腫瘤細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生一般預示著腫瘤惡性進程的開端[30]。在此過程中伴有E-cadherin表達的減少、N-cadherin和Vimentin等分子標志物的升高[31]。腫瘤細胞通過EMT使其失去與基底膜、細胞之間的黏附連接，獲得了較高的游走遷移、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)的能力，從而獲得間質(zhì)細胞的形態(tài)和特性，使得腫瘤細胞更易離開原位，發(fā)生原位浸潤或者遠處轉(zhuǎn)移[32]。例如，在HCC中，有研究者發(fā)現(xiàn)circ-000663在HCC組織中呈低表達，而高水平的circ-000663可以抑制HCC細胞的增殖來發(fā)揮抑癌作用，與HCC的EMT增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移有著重要的關(guān)系，這將在很大程度上改善HCC患者的預后，最大程度地降低HCC的復發(fā)與轉(zhuǎn)移[33]； Zhang X等[34]發(fā)現(xiàn)circSMAD2在肝癌組織中表達下調(diào)，且與腫瘤分化程度相關(guān)，circSMAD2過表達通過抑制miR-629的表達來抑制肝癌細胞的遷移、侵襲和EMT，從而促進肝癌細胞的EMT進程。而同樣地在胃癌中，也有學者發(fā)現(xiàn)circFNDC3B表達增加、circ-HIAT1的表達降低，促進了胃癌的EMT并誘導遠處轉(zhuǎn)移，這也是進展期胃癌患者預后不良的最主要原因[35-36]。Pu J等[37]在前期的研究中發(fā)現(xiàn)HCC的發(fā)展與hsa_circ_0000092/miR-338-3p/HN1的調(diào)控軸有關(guān)，主要機制是通過hsa_circ_0000092與miR-338-3p競爭性結(jié)合，從而降低miR-338-3p的表達，上調(diào)下游HN1的表達水平，加速了HCC的EMT進程，使得HCC組織中的腫瘤細胞發(fā)生增殖、遷移、侵襲以及生成血管，促進了HCC的進展。

2.4 circRNA與細胞自噬 自噬一般被認為是降解受損或不需要的蛋白質(zhì)和器官的一種非選擇性途徑。細胞自噬功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段中，起著不同的作用——抑癌或致癌作用，而circRNA與細胞自噬關(guān)系密切。在乳腺癌中，Liang GH等[38]發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的circCDYL在BC組織中的表達水平比在癌旁組織中的表達水平明顯升高，circCDYL通過miR-1275-ATG7/ULK1軸提高BC細胞自噬水平，在體內(nèi)外均增強了BC細胞的惡性進展；在臨床上，BC患者腫瘤組織和血清中circCDYL的增加與腫瘤負荷高、生存期短和臨床治療反應(yīng)差有關(guān)。在肺癌中，circHIPK3被認為是肺癌亞組中關(guān)鍵的自噬調(diào)節(jié)因子，Chen XY等[39]認為circHIPK3通過MIR124-3p-STAT3軸調(diào)節(jié)自噬誘導的細胞系(A549和H838)的自噬，從而促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，研究還揭示了高circHIPK3和linHIPK3比率(C/L比值)(>0.49)是患者預后不良的指標，尤其是在非小細胞肺晚期的癌患者中，適當上調(diào)circHIPK3/linHIPK3之間的比例可能對非小細胞肺癌(NSCLC)患者具有治療潛力。在口腔鱗癌中，circCDR1as通過AKT/ERK1/mTOR信號通路上調(diào)處于缺氧條件下的口腔鱗癌細胞自噬以促進腫瘤細胞存活，并且circCDR1as的高表達通過促進自噬提高了口腔鱗癌細胞在低氧微環(huán)境下的細胞活力，以此來適當?shù)丶訌妰?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來抑制癌細胞的凋亡，從而促進惡性腫瘤的進展[40]。在肝癌中，許多研究證明了circ-SPECC1在多種癌細胞中的表達水平明顯升高[41]，Zhang B等[42]也證實了circ-SPECC1能夠促進體內(nèi)腫瘤的生長，circ-SPECC1作為CeRNA，通過競爭性拮抗miR-33a的抑癌作用促進氧化應(yīng)激下肝癌細胞的增殖，并且抑制了細胞的凋亡，從而對肝癌的惡性進展起到促進作用；此外，在實驗中加入自噬抑制劑3-MA后證明了細胞自噬抑制在氧化應(yīng)激下HCC的進展。Lin SB等[43]的研究中發(fā)現(xiàn)circ_0027345可以通過與miR-345-5p結(jié)合來調(diào)控肝癌細胞的存活、凋亡、細胞周期、遷移、侵襲和自噬；circ_0027345過表達可通過下調(diào)Beclin 1和LC3-II/LC3-I的水平來抑制細胞凋亡和自噬，加速細胞周期進程，促進腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲。

3 小結(jié)

circRNA是近年來國內(nèi)外醫(yī)學界的研究熱點，目前研究主要集中在HCC發(fā)展過程中的機制，涉及了HCC的干性轉(zhuǎn)變、EMT、細胞miRNA表達異常以及細胞自噬等，并獲得較大的進展，并且已發(fā)現(xiàn)諸多circRNA-miRNA- mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。circRNA是一類比較穩(wěn)定的天然呈封閉環(huán)狀的非編碼RNA，它在多種惡性腫瘤細胞中都有異常表達——升高或降低，目前已發(fā)現(xiàn)在HCC組織中表達量升高的circRNA有hsa_circ_0056836[44]、hsa_circ_0003645[45]、hsa_circ_0016788等[46]，而hsa_circ_0001649[47]、circADAMTS13[48]等表達水平降低，它們很多是通過充當ceRNA與miRNA競爭性結(jié)合，靶向調(diào)控相應(yīng)通路來促進HCC的進展。隨著對circRNA在腫瘤致病機制方面研究的不斷加深，研究者們逐漸發(fā)現(xiàn)有的circRNA是通過促進或者抑制惡性腫瘤細胞的干性轉(zhuǎn)變來調(diào)控腫瘤的進展，也有的circRNA是促進腫瘤細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進程來加快腫瘤的惡性進展過程，還有的circRNA則是通過提高腫瘤細胞的自噬水平來抑制或加速腫瘤的進展方向。

綜上所述，在HCC中，大多數(shù)circRNA主要是作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)，通過充當miRNA海綿來解除對下游相對應(yīng)靶基因的抑制作用而發(fā)揮對腫瘤的調(diào)控作用。circRNA可與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)基因的剪接或轉(zhuǎn)錄；也可翻譯成蛋白質(zhì)或小肽；還參與表觀遺傳調(diào)控。也有一定數(shù)量的circRNA可以通過調(diào)節(jié)細胞干性、EMT以及自噬水平，進而調(diào)節(jié)HCC的生長、侵襲和遷移，從而影響患者的預后。由于circRNA能夠在各種組織中得到穩(wěn)定的表達，這大大增加了其作為生物標志物和治療靶標的潛力，因此，可以作為HCC患者早期診斷和有效治療的生物標記物。盡管對circRNA在肝癌中的功能研究已經(jīng)取得了很大進展，但大多數(shù)circRNA在肝癌進展中的功能和機制仍遠未完全闡明，并且要將其應(yīng)用于臨床還需要很長的時間，期待我們更多的努力探索。