細(xì)菌培養(yǎng)與PCR在細(xì)菌性痢疾檢測(cè)中的應(yīng)用效果比較

李江

摘要：目的? 對(duì)比細(xì)菌培養(yǎng)與聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)在細(xì)菌性痢疾檢測(cè)中的應(yīng)用效果。方法? 選取2018年1月～2019年1月在我院診治的220例腹瀉患者作為研究對(duì)象，分別采用細(xì)菌培養(yǎng)與聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)其糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比兩種方法檢出率及患者基本情況對(duì)檢出率的影響。結(jié)果? PCR檢出率50.45%高于細(xì)菌培養(yǎng)4.54%，且不同年齡患者PCR的檢出率均高于細(xì)菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;在PCR檢測(cè)中，培養(yǎng)陰性、非膿血便、年齡≥5歲與培養(yǎng)陽(yáng)性、膿血便、年齡<5歲病例PCR平均循環(huán)數(shù)對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 在細(xì)菌性痢疾的檢測(cè)中PCR檢測(cè)與細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)比具有更準(zhǔn)確的評(píng)估作用，利于臨床對(duì)細(xì)菌性痢疾人群的評(píng)估，具有臨床應(yīng)用的重要意義。同時(shí)不同年齡患者PCR檢出率存在差異，且膿血便可作為判斷志賀菌感染程度的指標(biāo)之一。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌培養(yǎng);聚合酶鏈反應(yīng);細(xì)菌性痢疾

Abstract：Objective? To compare the effects of bacterial culture and polymerase chain reaction （PCR） detection in the detection of bacterial dysentery.Methods? A total of 220 patients with diarrhea diagnosed in our hospital from January 2018 to January 2019 were enrolled in this study. Bacterial culture and polymerase chain reaction （PCR） were used to detect fecal specimens. Compare the detection rate of two methods and the impact of basic situation of patients on the detection rate.Results? The PCR detection rate was 50.45% higher than that of bacterial culture 4.54%， and the detection rate of PCR was higher than that of bacterial culture method，the difference was statistically significant （P<0.05）. In PCR detection， culture was negative and non-culture. There was a statistically significant difference in the average number of PCR cycles between pus and bloody stools， age≥5 years and culture-positive， pus and bloody stools， there was a statistically significant difference in the mean number of PCR cycles between the ages <5 years old （P<0.05）.Conclusion? PCR detection and bacterial culture in the detection of bacterial dysentery have a more accurate evaluation， which is conducive to clinical evaluation of bacterial dysentery， and has important clinical significance. At the same time， the PCR detection rates of patients of different ages are different， and pus and blood can be used as one of the indicators to judge the degree of Shigella infection.

Key words：Bacterial culture;Polymerase chain reaction;Bacterial dysentery

細(xì)菌性痢疾（bacterial dysentery）屬于臨床常見(jiàn)的多發(fā)病，是由志賀菌屬細(xì)菌引起的腸道傳染。患者主要伴有發(fā)熱、腹瀉、腹痛、黏液性膿血樣便癥狀，嚴(yán)重影響患者的身體健康[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的不斷提高，衛(wèi)生條件顯著改善，細(xì)菌性痢疾發(fā)病率有所下降。但是志賀菌感染仍然是我國(guó)現(xiàn)下重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[2]。臨床常用的檢測(cè)方法有細(xì)菌培養(yǎng)、PCR檢測(cè)。但有研究顯示，細(xì)菌檢測(cè)確診細(xì)菌性痢疾診斷率不高，容易出現(xiàn)漏診。因此，本研究選取2018年1月～2019年1月在我院診治的220例腹瀉患者作為研究對(duì)象，對(duì)比細(xì)菌培養(yǎng)與PCR檢測(cè)在細(xì)菌性痢疾檢測(cè)中的應(yīng)用效果，為臨床提供一定的參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料? 選取2018年1月～2019年1月在湖北省荊州市第三人民醫(yī)院診治的220例腹瀉患者進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合細(xì)菌性痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn);②糞便鏡見(jiàn)均可見(jiàn)白胞每高倍視野15個(gè)以上，可見(jiàn)少量紅細(xì)胞。③年齡0～53歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有心、肝、腎等嚴(yán)重系統(tǒng)疾病者。男性124例，女性96例;年齡0～53歲，平均年齡（35.17±2.11）歲。

1.2方法

1.2.1儀器、試劑? 美國(guó)ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀，JIDI-4D-WS自動(dòng)平衡實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)。培養(yǎng)基包括：SS培養(yǎng)基;麥康凱培養(yǎng)基;亞硝酸鹽增菌培養(yǎng)基;GN增菌培養(yǎng)基分離/增菌培養(yǎng);雙糖鐵培養(yǎng)基;三糖鐵培養(yǎng)基。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)? 培養(yǎng)基內(nèi)接種糞便標(biāo)本，溫度控制在37℃，培養(yǎng)24 h 后將可疑菌落挑出，并進(jìn)行生化鑒定，血清型由血清凝集反應(yīng)判斷。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：有典型菌落出現(xiàn)，經(jīng)生化鑒定，提示志賀菌感染。

1.2.3 PCR技術(shù)檢測(cè)? 引物選擇：擴(kuò)增志賀ipaH基因片段引物堿基序列。從培養(yǎng)14 h的SS瓊脂平板菌落中提取DNA，接種單菌落于LB或腦心平板，不間斷的連續(xù)畫(huà)線，在37℃培養(yǎng)18～24 h。再取150 μl蒸餾水，與其充分混合數(shù)接種環(huán)菌苔，在100℃水煮10 min，離心后取上清液，并于零下20℃存放待檢測(cè)。使用PBS緩沖液洗滌、沉淀后再次離心，提取菌體后置于TE緩沖液、10%SDS及蛋白酶K內(nèi)消化60 min，用量分別取467 μl、30 μl、3 μl。DNA抽提采用取酚-氯仿法。dNTP 混合物、氯化鎂及相應(yīng)引物終濃度各取200 μmol/L、2 mmol/L 與100 pmol/L，10×PBS 緩沖液、Q-solution、Taq-DNA 聚合酶及模板DNA 各取5 μl、5 μl、1.25 U 及2 μl。在94℃溫度下預(yù)變性、變性各7 min 和1 min，退火與延伸溫度各為60℃和72℃，時(shí)間各為2 min 和4 min，PCR 循環(huán)數(shù)共40 個(gè)。能檢測(cè)到產(chǎn)物的循環(huán)數(shù)≤38則為陽(yáng)性。含有化學(xué)試劑10%福爾馬林、蘇木素、伊紅、EDTA、苯酚、氯仿、2%SDS對(duì)PCR存在抑制的陰性標(biāo)本[3]。

1.3觀察指標(biāo)? 對(duì)比PCR和細(xì)菌培養(yǎng)兩種方法細(xì)菌性痢疾檢出率、PCR檢出結(jié)果年齡分布特點(diǎn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 數(shù)據(jù)分析使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料采用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，兩組間比較采用？字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同年齡患者細(xì)菌性痢疾檢出率比較? PCR檢出率高于細(xì)菌培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且不同年齡患者PCR的檢出率均高于細(xì)菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2檢測(cè)結(jié)果的分布特點(diǎn)? 在PCR檢測(cè)中，培養(yǎng)陰性、非膿血便、年齡>5歲與培養(yǎng)陽(yáng)性、膿血便、年齡<5歲病例PCR平均循環(huán)數(shù)對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

3討論

隨著細(xì)菌流行病學(xué)的研究不斷進(jìn)展，關(guān)于PCR的實(shí)踐研究已有大量報(bào)道[4]。PCR檢測(cè)細(xì)菌性痢疾，具有快速、高特異性、高敏感性等特點(diǎn)，并且該方法對(duì)樣本數(shù)少或某些難鑒別血清學(xué)標(biāo)記鑒別的腹瀉菌種也適用。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)，且操作復(fù)雜，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果低，容易漏診。相關(guān)研究顯示標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果中[5]，志賀菌屬ipaH在PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，但是不一定發(fā)病，而ipaH及ial雙基因同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本為細(xì)菌性痢疾患者。因此，比較PCR于細(xì)菌培養(yǎng)在檢測(cè)志賀菌上的區(qū)別具有重要的臨床意義。PCR檢測(cè)原理決定PCR循環(huán)數(shù)可影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。從而PCR循環(huán)數(shù)也可以作為評(píng)價(jià)PCR檢測(cè)特異性和準(zhǔn)確性的一個(gè)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，PCR檢出率為33.63%，高于細(xì)菌培養(yǎng)4.54%，且不同年齡患者PCR的檢出率均高于細(xì)菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;由此可見(jiàn)PCR檢測(cè)志賀菌率高于細(xì)菌培養(yǎng)，與已有的研究結(jié)果基本一致。在PCR檢測(cè)中，培養(yǎng)陰性、非膿血便、年齡≥5歲與培養(yǎng)陽(yáng)性、膿血便、年齡<5歲病例PCR平均循環(huán)數(shù)對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示膿血便可為判斷志賀菌感染程度的指標(biāo)之一，重癥感染為腸上皮黏膜破裂引起病原菌快速、大量增殖所致。相對(duì)于輕癥病例，重癥感染者的排泄物中細(xì)菌載量更高。PCR檢測(cè)可以避免重復(fù)檢測(cè)帶來(lái)的繁復(fù)工作量，且解決了細(xì)菌培養(yǎng)受細(xì)菌載量、細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)抑制等因素的影響而造成的檢出率偏低。

綜上所述，PCR檢測(cè)ipaH基因有利于準(zhǔn)確評(píng)估人群中細(xì)菌痢疾的發(fā)病率，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得借鑒。

參考文獻(xiàn)：

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收稿日期：2019-4-18;修回日期：2019-4-28

編輯/馮清亮