一種水稻穗腐病新病原的鑒定

陳利軍,王春生,田雪亮,智亞楠,劉焱琨,衛(wèi)云飛

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.河南省豫南農(nóng)作物有害生物綠色防控院士工作站，河南 信陽 464000； 3.河南科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來，水稻穗腐病(Rice spikelet rot disease，RSRD)在我國各稻區(qū)的發(fā)生危害逐年加重[1-8]。水稻穗腐病危害稻穗，造成谷粒腐壞、變色、結(jié)實率降低或不實、稻米畸形等，不僅影響產(chǎn)量、降低稻米品質(zhì)，同時病原菌還會產(chǎn)生毒素，對食用者的安全和健康構(gòu)成危害，已成為水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)產(chǎn)的限制因子之一[1-6]。

水稻穗腐病由多種病原真菌復(fù)合侵染引起[1-3,6-8]。目前，已確認(rèn)的病原菌有9種：層出鐮刀菌(Fusariumproliferates)、藤倉鐮刀菌(F.fujikuroi)、擬輪枝鐮刀菌(F.verticillioidess)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、澳大利亞平臍孺孢(Bipolarisaustraliensis)、新月彎孢菌(Curvularialunata)、稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)和細(xì)交鏈格孢(Alternariatenuis)。不同種植生態(tài)區(qū)水稻穗腐病的病原菌種類不完全相同，長江流域以層出鐮刀菌和新月彎孢菌為主，江淮流域以層出鐮刀菌、新月彎孢菌和稻黑孢菌為主[6]。

水稻穗腐病原菌侵染稻穗谷粒后，初期一般表現(xiàn)為谷粒穎殼有黃褐色或鐵銹色橢圓形小斑點，后期病斑擴大并變?yōu)楹稚梁诤稚?，有些伴有霉層[5]。水稻是河南省信陽市的主要糧食作物，近年來，水稻穗腐病的危害逐年加重。在對信陽市水稻穗腐病的調(diào)查研究過程中，發(fā)現(xiàn)部分受穗腐病危害的水稻谷粒外穎開裂，外露籽粒伴有白色、粉紅色、黑色或藍(lán)綠色霉層。經(jīng)初步鏡檢鑒定，谷粒上藍(lán)綠色霉層為一種青霉(Penicilliumsp.)病菌，在水稻穗腐病病原菌中未見報道。為了明確該青霉與水稻穗腐病的關(guān)系，本研究對該菌進行分離純化、致病性測定、形態(tài)學(xué)鑒定和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，以期進一步明確信陽市水稻穗腐病病原菌種類，為防控措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病原菌分離和純化

2015年8月，從信陽農(nóng)林學(xué)院水稻研究所三橋試驗基地采集病株樣本，記錄樣本信息后帶至實驗室，在超凈工作臺上用接種針挑取病害材料表面的霉層，接種到含硫酸鏈霉素(50 μg/mL)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上。待培養(yǎng)基上菌落形成后，采用水瓊脂單孢純化法對菌株進行純化，純化后的單菌落接種至PDA斜面，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌致病性測定

于2017年8月在信陽農(nóng)林學(xué)院水稻研究所三橋試驗基地開展致病性測定，接種水稻品種為紅優(yōu)2009。采用穎內(nèi)注射法接種[4]，將供試菌株制成5×106個/mL孢子懸浮液，于揚花始期注射，每小穗注射10粒。接種后7 d，觀察發(fā)病情況。取接種發(fā)病谷粒，按照1.1中的方法分離病原物，將分離純化得到的菌株與原接種菌株進行形態(tài)學(xué)比較。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

供試菌株的形態(tài)學(xué)鑒定參照孔華忠[9]的方法進行，使用查氏瓊脂(CA)培養(yǎng)基、查氏酵母膏瓊脂(CYA)培養(yǎng)基和25%甘油硝酸鹽瓊脂(G25N)培養(yǎng)基，25 ℃下培養(yǎng)。參照康振生[10]的方法用掃描電鏡觀察菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 菌株DNA提取 將供試菌株孢子懸浮液均勻涂抹在鋪有1層無菌玻璃紙的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d后刮取玻璃紙上的菌絲，采用CTAB法[11]提取菌株基因組DNA。

1.4.2 多基因序列擴增 采用PCR擴增供試菌株核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)、β-tubulin微管蛋白基因(BenA)和鈣調(diào)蛋白基因(CaM)部分序列。PCR反應(yīng)體系為20 μL：DNA模板(100 ng/μL)1 μL、上下游引物各1 μL、PCR mix 10 μL、Taq酶(5 U/μL)0.25 μL、ddH2O 6.75 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增所用引物見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京擎科生物科技有限公司測序。

表1 PCR擴增所用引物Tab.1 Primers for PCR amplification

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中對供試菌株的ITS、BenA和CaM序列的測序結(jié)果進行BLAST比對，對該病原菌種屬進行初步鑒定。選取青霉菌屬Lanata-Divaricata組中代表種的模式菌株(Ex-type strain)及外群菌株[15]，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載上述菌株的ITS、BenA和CaM序列，具體菌株和基因序列見表2。利用ClustalX軟件對供試菌株和下載菌株序列進行比對分析。比對后的序列用BioEdit軟件編輯后，利用Sequence Matrix軟件將所有菌株的ITS、BenA和CaM序列拼接在一起，將拼接好的多基因序列導(dǎo)入MEGA 7中，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析所用青霉屬菌株相關(guān)信息Tab.2 Related information of Penicillium strains used in phylogenetic analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 田間水稻受害癥狀

受侵染的水稻同其他水稻穗腐病菌危害的癥狀相似，穎殼初期也呈現(xiàn)黃褐色至黑褐色，但后期外穎開裂，外露藍(lán)綠色霉層，谷粒部分受害或無谷粒(圖1A)。

A：田間；B：接種7 d

2.2 病原菌分離及致病性測定

將通過PDA培養(yǎng)基分離得到的菌株初步確認(rèn)為青霉菌屬(圖2)，菌株編號為R1。穎內(nèi)注射接種菌株R1孢子懸浮液后，水稻穗粒外穎開裂，外露藍(lán)綠色霉層，穎內(nèi)無谷粒或谷粒遭受危害，同田間受害癥狀相似(圖1B)。對發(fā)病谷粒進行再分離，發(fā)現(xiàn)分離物與接種菌株有相同的形態(tài)學(xué)特征。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

對菌株R1進行菌落形態(tài)觀察，結(jié)果見圖2。25 ℃條件下，在CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d后，菌落直徑介于62～79 mm，近平坦，質(zhì)地絨狀，菌落正面暗綠色，反面橙黃色，分生孢子大量產(chǎn)生，易脫落；相同條件下在CYA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑介于44～59 mm，正面暗綠色，反面橘褐色，分生孢子大量產(chǎn)生；在G25N培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑僅介于10～18 mm，菌落正面暗綠色，反面中部黃色。

對菌株R1進行顯微形態(tài)觀察，結(jié)果見圖3。該菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)呈掃帚狀，帚狀枝通常雙輪生，?；枯?～3個，彼此通常較緊貼，瓶梗每輪4～8個，分生孢子長橢圓形，(4.3～5.3)μm ×(3.2～3.9)μm。掃描電鏡觀察結(jié)果表明，孢子壁呈波紋狀褶皺。R1菌株形態(tài)學(xué)特征與草酸青霉(Penicilliumoxalicum)相似。

圖2 不同培養(yǎng)基上菌株R1菌落形態(tài)Fig.2 Colony characteristics of strain R1 on different mediums

A：分生孢子梗(光學(xué)顯微鏡)；B：分生孢子梗(掃描電鏡)；C：分生孢子(掃描電鏡)；標(biāo)尺=10 μm

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

對菌株R1的ITS、BenA、CaM序列進行PCR擴增和測序，GenBank登記號分別為MH265216、MH265217、MH265218。通過BLAST比對，菌株R1與草酸青霉模式菌株(CBS 219.30)序列的相似性達到98%。利用MEGA 7軟件構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株R1與草酸青霉模式菌株(CBS 219.30)處于同一分支，支持率為100%(圖4)。因此，菌株R1被鑒定為草酸青霉。

3 結(jié)論與討論

草酸青霉為常見的腐生菌，主要分布在土壤以及腐爛雜物、枯枝落葉上，在玉米、稻谷、小麥等谷物上也有分布，但都是腐生性[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，草酸青霉能溶解土壤中的難溶性磷，增強作物對土壤磷的吸收利用，并從關(guān)鍵性土壤酶和土壤微生物方面改善土壤的生物學(xué)特性，促進植物生長[16]；草酸青霉對一些植物病害也具有顯著的生防功效[17-19]，是潛在的生防真菌，尤其對Fusariumspp.引起的枯萎病有較好的防控效果[19]。

而近年來有關(guān)草酸青霉引起植物病害的報道逐漸增多，這些植物包括甘薯(Ipomoeabatatas)[20]、膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus)[21]、番茄(Lycopersiconesculentum)[22]等，該病菌引起的病害多稱為藍(lán)霉病(Blue mold)。已發(fā)現(xiàn)草酸青霉寄生玉米引起穗腐病[23]，侵染高粱引起青霉穎枯病[24]。在水稻方面，柴榮耀等[25]從水稻病穗分離到21個屬的真菌，其中青霉Penicilliumsp.的檢出頻率最高，因認(rèn)為其是腐生菌，而未進行致病性測定。

本研究通過田間病害癥狀觀察，依據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)特征及基于ITS、BenA和CaM序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，并根據(jù)致病性測定結(jié)果，將草酸青霉確定為水稻穗腐病的一種新病原菌。草酸青霉侵染水稻引起水稻穗腐病尚屬首次報道。

P.glabrum為外群；T代表模式菌株