高粱TCP基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析

鄭 玲，白雪婷，李會(huì)云

(洛陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471934)

TCP基因是3個(gè)不同物種的4個(gè)基因的縮寫(xiě)，分別是玉米中的TB1(Teosinte branched 1)基因，金魚(yú)草中的CYC(Cycloidea)基因和水稻中的PCF1(Proliferating cell factors 1)和PCF2基因[1-3]。TCP是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，大多數(shù)TCP蛋白在N端有1段約60個(gè)氨基酸殘基組成的與DNA結(jié)合的非典型bHLH(Basic-helix-loop-helix)保守區(qū)，又稱(chēng)為T(mén)CP結(jié)構(gòu)域。此外，TCP蛋白還存在1個(gè)保守的R結(jié)構(gòu)域，R結(jié)構(gòu)域并不是所有的TCP轉(zhuǎn)錄因子共有的，它富含精氨酸、賴(lài)氨酸和谷氨酸等極性氨基酸，可以形成1個(gè)親水性的ɑ螺旋[2，4]。

根據(jù)TCP基因家族結(jié)構(gòu)域同源性，可將TCP基因家族分為ClassⅠ和ClassⅡ 2個(gè)類(lèi)群。ClassⅡ的TCP結(jié)構(gòu)域比ClassⅠ多了4個(gè)氨基酸殘基[1]。ClassⅠ中最先確定的功能基因是水稻的PCF1和PCF2，因此，TCP ClassⅠ也被稱(chēng)為PCF(或TCP-P)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtTCP14基因參與調(diào)控種子的胚胎發(fā)育[6]；AtTCP15基因不僅參與節(jié)間長(zhǎng)度調(diào)控，還與葉片發(fā)育調(diào)控有關(guān)[7]；AtTCP20基因參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、茉莉酸(JA)生物合成及葉片衰老[8-9]；AtTCP22基因在葉片衰老中起負(fù)調(diào)控作用，并與AtTCP15基因存在功能冗余現(xiàn)象[10]；AtTCP16基因在發(fā)育的小孢子中表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植株中下調(diào)該基因可導(dǎo)致1/2的花粉異常[11]；AtTCP11基因與維管束后生木質(zhì)部導(dǎo)管分子的分化和形成有關(guān)[12]；AtTCP17基因參與光信號(hào)傳導(dǎo)和生長(zhǎng)素合成從而調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長(zhǎng)[13]。

ClassⅡ類(lèi)(TCP-C)[7]成員又可分為CYC/TB1和CIN (Cincinnata)2個(gè)亞類(lèi)，CYC/TB1亞類(lèi)中包含1段非保守的谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸的延伸結(jié)構(gòu)[14]；CIN亞類(lèi)中包含有microRNA miR-319的靶基因[15]。CIN亞類(lèi)起源于金魚(yú)草(Antirrhinum)中的CINCINNATA，包含涉及側(cè)生器官發(fā)育的基因；而CYC/TB1亞類(lèi)(或ECE亞類(lèi))包含腋分生組織發(fā)育成花或側(cè)枝的基因[16]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米TB1基因是玉米頂端優(yōu)勢(shì)的決定因素之一，此外，TB1基因還參與調(diào)控玉米葉分生組織的分化，防止在低節(jié)點(diǎn)生成芽以及在高節(jié)點(diǎn)上生成雌花序[16]；水稻TB1基因也參與調(diào)控水稻側(cè)枝發(fā)育[17]；TB1與其同源基因(AtTCP12、AtTCP18、SlTCP7、SlTCP9)都在腋芽中表達(dá)，調(diào)控側(cè)生器官發(fā)育[18]。

高粱(SorghumbicolorL.)是禾本科高粱屬植物，葉和玉米葉很像，具有圓錐形花序和紅褐色籽粒。高粱是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，其籽粒是釀造茅臺(tái)、竹葉青等諸多名酒的主要原材料，在未來(lái)的生物能源中也將發(fā)揮重要作用[19]。近年來(lái)，由于人們發(fā)現(xiàn)TCP基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，其家族成員的全基因組鑒定和分析成為研究熱點(diǎn)，目前已在多個(gè)物種中進(jìn)行了研究，如大豆[20]、辣椒[21]、毛竹[22]、擬南芥[23]、番茄[24]、玉米[25]等，還未見(jiàn)關(guān)于高粱TCP 基因家族全基因組鑒定和分析的報(bào)道。為此，對(duì)高粱TCP家族基因進(jìn)行鑒定和分析，并推測(cè)高粱TCP家族部分基因的功能，分析高粱TCP基因在不同器官和非生物脅迫下的表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步研究TCP基因在高粱生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

高粱的TCP序列來(lái)自PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)、Phytozome(http://phytozome.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)TCP基因序列來(lái)自PlantTFDB網(wǎng)站； TCP基因在高粱各組織中的表達(dá)量數(shù)據(jù)來(lái)自qTeller(http://qteller.com/)網(wǎng)站。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高粱TCP基因家族成員的鑒定 從Pfam 網(wǎng)站(http://pfam. sanger.ac.uk/)下載TCP基因家族種子序列(PF03634),并以PF03634為搜索序列在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://phytozome.net/)中下載全部高粱TCP基因序列(E值小于1×10-10)。將下載的結(jié)果與PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中下載的序列進(jìn)行比對(duì)，去除冗余，得到候選基因。利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)在線驗(yàn)證候選基因，鑒定其編碼蛋白質(zhì)是否含有TCP結(jié)構(gòu)域。使用ExPASy(http//www.expasy.org/)對(duì)最終所篩選出的氨基酸序列進(jìn)行在線分析，以確定蛋白質(zhì)的氨基酸長(zhǎng)度、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性平均值。

1.2.2 高粱TCP基因的染色體定位 利用Mapinspect工具對(duì)高粱TCP基因進(jìn)行染色體定位。

1.2.3 高粱TCP蛋白保守結(jié)構(gòu)域、保守基序(Motif)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將TCP基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域序列在ClustalX軟件上進(jìn)行比對(duì)，在GeneDoc軟件中進(jìn)行灰度標(biāo)注。利用在線網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)高粱TCP基因家族成員進(jìn)行Motif分析，參數(shù)中預(yù)測(cè)數(shù)目設(shè)置為10，其余均為默認(rèn)設(shè)置。將所有的高粱TCP蛋白和PlantTFDB網(wǎng)站下載的擬南芥TCP蛋白在MEGA 6.0軟件中通過(guò)最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 高粱TCP基因表達(dá)模式分析 通過(guò)qTeller數(shù)據(jù)庫(kù)(http://qteller.com/)得到高粱TCP基因在不同組織中的表達(dá)量，整合數(shù)據(jù)后通過(guò)MEV 4軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱TCP基因家族成員的鑒定及染色體分布

經(jīng)篩選鑒定，共獲得27個(gè)高粱TCP基因(表1)。高粱TCP基因編碼的氨基酸數(shù)目差異較大，最多可以編碼627個(gè)氨基酸(SbTCP10),最少編碼80個(gè)氨基酸(SbTCP5),平均編碼325個(gè)氨基酸。高粱27個(gè)TCP蛋白的分子質(zhì)量在8 194.28～65 896.42 ku，等電點(diǎn)平均值為7.9，其中有17個(gè)大于7.0，呈堿性，有10個(gè)小于7.0，呈酸性。

27個(gè)高粱TCP基因在染色體上的位置見(jiàn)圖1。

表1 高粱TCP基因家族成員基本信息

圖1 高粱TCP基因染色體定位Fig.1 Chromosome localization analysis of TCP genes in sorghum

27個(gè)高粱基因在10條染色體上不均勻分布，5號(hào)染色體上沒(méi)有分布。其中，1、4、6號(hào)染色體上各有3個(gè)基因，2、9號(hào)染色體上各有4個(gè)基因，3號(hào)染色體上有6個(gè)基因，7號(hào)染色體上有2個(gè)基因，8、10號(hào)染色體上各有2個(gè)基因。在1號(hào)染色體上SbTCP1和SbTCP2聚為一簇，3號(hào)染色體上的SbTCP8、SbTCP9和SbTCP10聚為一簇， 6號(hào)染色體上的SbTCP17和SbTCP18聚為一簇，9號(hào)染色體上的SbTCP23—SbTCP26基因聚為一簇。

2.2 高粱TCP蛋白的分類(lèi)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將27個(gè)高粱TCP蛋白與24個(gè)擬南芥TCP蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖2)。結(jié)果表明，27個(gè)高粱TCP蛋白可分為2類(lèi)：ClassⅠ和ClassⅡ。ClassⅠ(PCF)包含10個(gè)高粱TCP蛋白、13個(gè)擬南芥TCP蛋白；ClassⅡ中的CYC/TB1包含3個(gè)高粱TCP蛋白、3個(gè)擬南芥TCP蛋白， CIN包含14個(gè)高粱TCP蛋白、8個(gè)擬南芥TCP蛋白。

圖2 高粱和擬南芥TCP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of TCP proteins in sorghum and Arabidopsis

2.3 高粱TCP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)高粱TCP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)(圖3)發(fā)現(xiàn)，27個(gè)高粱TCP蛋白均包含有TCP結(jié)構(gòu)域，即bHLH結(jié)構(gòu)域,且在Basic區(qū)保守程度較高。ClassⅠ類(lèi)成員在Basic區(qū)缺少第12、13、14、16位的4個(gè)氨基酸，ClassⅡ類(lèi)的CIN亞組的SbTCP5蛋白缺少雙螺旋區(qū)的氨基酸。在這27個(gè)TCP蛋白中發(fā)現(xiàn)2個(gè)存在R結(jié)構(gòu)域，分別為SbTCP3、SbTCP4(圖4)。

2.4 高粱TCP蛋白的Motif分析

通過(guò)MEME在線分析高粱TCP蛋白的Motif,將鑒定的10個(gè)Motif命名為Motif1—Motif10(圖5)。結(jié)合高粱系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ClassⅠ類(lèi)成員都只含有Motif1和Motif9(除SbTCP13還含有1個(gè)Motif10外)；ClassⅡ類(lèi)中除SbTCP5蛋白只含有1個(gè)Motif5外，其他成員都有1個(gè)Motif1和1個(gè)Motif5,且ClassⅡ類(lèi)的CYC/TB1亞類(lèi)中SbTCP3、SbTCP6、SbTCP20蛋白都僅含1個(gè)Motif1和1個(gè)Motif5,而ClassⅡ類(lèi)的CIN亞類(lèi)中SbTCP22蛋白也僅有1個(gè)Motif1和1個(gè)Motif5,其余TCP蛋白還含有其他Motif。

2.5 高粱TCP基因的表達(dá)模式和功能分析

由圖6可知，高粱TCP基因在高粱各組織中的表達(dá)量不同。大部分高粱TCP基因在根、嫩枝、胚乳、胚、種子、葉片、花序原基、早期花序、雌蕊、花藥、花粉中均有所表達(dá)。但ClassⅡ中的CYC/TB1亞類(lèi)基因(SbTCP3/6/20)在這些組織中都不表達(dá)或表達(dá)量很低。SbTCP25/26/24/23在胚、早期花序、葉片中表達(dá)量較高；SbTCP1/2在胚、早期花序、雌蕊、種子、花序原基中表達(dá)量較高；SbTCP8/9/10在胚、雌蕊、早期花序、種子中表達(dá)量較高；SbTCP17/18在胚、嫩枝、早期花序、雌蕊、種子中表達(dá)量較高。其他TCP基因在高粱各組織中的表達(dá)量各不相同，其中在雌蕊、胚、早期花序中表達(dá)量較高，在胚乳、花粉和花藥中表達(dá)量很低?？傮w來(lái)看，ClassⅠ大部分成員在種子、胚、雌蕊、早期花序中表達(dá)量較高，ClassⅡ中的CIN亞類(lèi)在種子、葉片、胚、雌蕊、早期花序中的表達(dá)量也較高。

圖3 高粱TCP蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)分析Fig.3 Alignment of conserved sequence of TCP proteins in sorghum

圖4 高粱TCP蛋白R(shí)結(jié)構(gòu)域序列分析Fig.4 Alignment of the R-domain sequence of TCP proteins in sorghum

圖5 高粱TCP蛋白家族成員Motif分析Fig.5 Conserved motifs analysis of TCP proteins in sorghum

圖6 高粱TCP基因表達(dá)模式分析Fig.6 Expression pattern analysis of TCP genes in sorghum

從qTeller網(wǎng)站下載高粱根和嫩枝TCP基因在ABA(脫落酸)、NaOH、PEG(聚乙二醇)和H2O處理下的表達(dá)量,其中ABA處理與NaOH處理進(jìn)行對(duì)比分析，PEG處理與水處理進(jìn)行對(duì)比分析。由圖6可知，與 NaOH處理相比，ABA處理后根中大部分TCP基因表達(dá)量降低，如SbTCP25/26/24/23/1/2/4/8/9/10/17/18/14/19/16/15/27等；在嫩枝中有5個(gè)TCP基因表達(dá)量明顯降低，包括SbTCP25/26/24/23/12，2個(gè)TCP基因(SbTCP19/15)表達(dá)量明顯升高。與水處理相比，PEG處理根中大部分TCP基因表達(dá)量明顯升高，如SbTCP25/26/24/23/12/11/14/15/27等；在高粱嫩枝中，大部分TCP基因表達(dá)量下降，如SbTCP25/26/24/23/12/10等，但有個(gè)別基因表達(dá)量升高，如SbTCP4/15等。

3 結(jié)論與討論

TCP是植物特異轉(zhuǎn)錄因子家族，不同物種中TCP家族基因數(shù)量不同，如大豆中有54個(gè)TCP基因[20]，辣椒中有30個(gè)[21]，毛竹中有19個(gè)[22]，擬南芥中有24個(gè)[23]。高粱TCP成員與這些植物的TCP家族成員有著共同的特征，都含有保守的TCP結(jié)構(gòu)域，且只有2個(gè)成員含有R結(jié)構(gòu)域，而番茄中有6個(gè)成員具有R結(jié)構(gòu)域[24]，擬南芥中有5個(gè)成員具有R結(jié)構(gòu)域[23]。

已有研究證實(shí)，大部分TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中起重要作用，例如配子體發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]、線粒體生物合成、植物生物節(jié)律調(diào)節(jié)、側(cè)枝發(fā)育[13]、花發(fā)育[9]、種子萌發(fā)[8]以及葉片發(fā)育[9]等。高粱的大部分TCP基因在種子、胚、雌蕊、早期花序中表達(dá)量較高，在胚乳、花粉和花藥中表達(dá)量較低，僅ClassⅠ(PCF)類(lèi)成員的SbTCP21在花藥中表達(dá)量較高， ClassⅠ大部分成員在種子、胚、雌蕊、早期花序中表達(dá)量較高。研究表明，擬南芥的ClassⅠ類(lèi)基因AtTCP11/14/16在種子萌發(fā)和配子體發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)控作用[26]，暗示高粱ClassⅠ成員可能也有類(lèi)似作用。而ClassⅡ中的CYC/TB1亞類(lèi)基因(SbTCP3/6/20)在各組織中不表達(dá)或表達(dá)量很低，CIN亞類(lèi)的SbTCP5基因也不表達(dá)或表達(dá)量很低。CIN亞類(lèi)大部分成員在葉片、雌蕊、胚、種子、早期花序中表達(dá)量較高，擬南芥CIN亞類(lèi)的AtTCP2/3/4/5/10/13/17/24基因參與擬南芥葉片、花發(fā)育過(guò)程[8]，暗示高粱CIN成員可能也有類(lèi)似作用。

TCP家族是一類(lèi)與系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的植物特異轉(zhuǎn)錄因子，它可以在激素信號(hào)的上下游發(fā)揮作用或與激素信號(hào)互作來(lái)促進(jìn)/抑制激素合成，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，最終對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起調(diào)控作用[26]。在大豆中研究發(fā)現(xiàn)，GmCYL(CYC/TB1-like)基因?qū)儆赥CP轉(zhuǎn)錄因子家族ClassⅡ類(lèi)的CYC/TB1亞類(lèi)成員，在葉和根中，分別不同程度地受ABA、油菜素內(nèi)酯(BR)、氨基-環(huán)丙烷羧酸(ACC)、水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)等誘導(dǎo)表達(dá)[27]。擬南芥AtTCP18基因受外源生長(zhǎng)素的調(diào)控，從而參與植物分枝的形成過(guò)程[23]。ABA是一種重要的外界脅迫信號(hào)激素，參與維持和促進(jìn)種子和芽的休眠[26]。在小麥的所有TCP基因中TaTCP5基因的表達(dá)量在熱和干旱脅迫下明顯上調(diào)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA誘導(dǎo)下，根和嫩枝中的大部分基因的表達(dá)量下降；PEG處理下，根中大部分基因的表達(dá)量升高，嫩枝中大部分基因的表達(dá)量下降。在ABA和PEG脅迫下，上調(diào)表達(dá)的TCP基因可能在植物干旱脅迫響應(yīng)中起重要作用。但是這些基因具體的功能和作用機(jī)制還要通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。