基于卵巢Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)的補(bǔ)腎助孕方干預(yù)黃體功能不全大鼠生殖功能的機(jī)制研究*

石明晴 周惠芳 徐曉飛 江偉華#

1 浙江省麗水市中醫(yī)院 浙江 麗水 323000

2 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇 南京 210029

黃體功能不全（LPD）是引起不孕癥的內(nèi)分泌因素之一，大量研究顯示有5%～10%的不孕癥由LPD引起[1]。Kisspeptin是調(diào)控女性生殖內(nèi)分泌功能的一種多肽類激素，可通過介導(dǎo)雌二醇的正負(fù)反饋?zhàn)饔枚{(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌，繼而參與調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)的生長發(fā)育、生殖激素的分泌，以及維持下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸的穩(wěn)定[2]。本文擬研究夏桂成教授經(jīng)驗(yàn)方補(bǔ)腎助孕方是否通過影響卵巢的Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)，從而促進(jìn)成熟卵泡排卵和健全黃體，以觀察補(bǔ)腎助孕方對Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：8周齡雌性SD大鼠（體重200～220g）購自南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（許可證號：SYXK-2013-0025）。SPF環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 藥物制備方法：研磨地屈孕酮片（荷蘭Abbott Biologicals B.V.，10mg/片，批號：H20170221）和米非司酮片（浙江仙琚制藥股份有限公司，25mg/片，批號：H20000649），分別配置成濃度0.4、1.0mg/ml的藥液。補(bǔ)腎助孕方含懷山藥、菟絲子各15g，炒白芍、鹿角片、山萸肉各10g，醋柴胡6g等8味中藥，中藥飲片由南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂提供，采用水提法將補(bǔ)腎助孕方制成2g/ml的藥液。

1.2.2 動物分組、造模及給藥：6周齡雌性SD大鼠40只，隨機(jī)分為對照組（A）、LPD模型組（B）、補(bǔ)腎助孕方組（C）、地屈孕酮陽性對照組（D）。以上3種藥物均按“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”換算。動物模型的制備按照相關(guān)文獻(xiàn)描述的內(nèi)容進(jìn)行處理[3]。每天8：00進(jìn)行陰道涂片，發(fā)現(xiàn)典型動情期表現(xiàn)的時(shí)間（排卵后黃體早期）即記為D1，除對照組外，其余3組大鼠分別在D1和D5灌胃米非司酮混懸液，并從第3個(gè)性周期（D9）開始，分別于D9、D13 16：00以及D10、D14 8：00，給予生理鹽水、地屈孕酮藥液和補(bǔ)腎助孕方溶液分別灌胃模型組、地屈孕酮組及補(bǔ)腎助孕方組，對照組在以上的各個(gè)給藥時(shí)間點(diǎn)分別給予灌胃生理鹽水。每組大鼠給藥濃度均為100g體質(zhì)量給予1ml藥液。

1.2.3 樣本收集：各組大鼠于D18 14：00，采用10%的水合氯醛和規(guī)格為2ml∶0.1g的氯胺酮注射液混勻（濃度為100g/0.2ml）進(jìn)行腹腔注射麻醉，成功麻醉后，用剪刀打開大鼠的盆腔和腹腔，經(jīng)腹主動脈進(jìn)行動脈血的采集；然后斷頭處死大鼠，分離子宮、卵巢周圍軟組織后將子宮和雙側(cè)附件取出并在顯微鏡下觀察形態(tài)。取部分組織置于-80℃冰箱凍存，并將剩余組織用于切片。將上述獲得的動脈血采用1500g速度離心10min后，取上清獲得血清樣本。樣本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Elisa法檢測血清孕酮（P）、卵泡刺激素（FSH）及促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）含量：按照ELISA試劑盒（中國，北京中杉金橋有限公司，96T）說明書操作，記錄在酶標(biāo)儀450nm和570nm波長處的各處光密度（OD值）。繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中E2、P、LH及FSH含量。

1.2.5 Western Blot測定卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表達(dá)水平：將處于冷凍狀態(tài)的卵巢組織加入（武漢Boster公司）裂解液∶PMSF=100∶1，進(jìn)行裂解，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，進(jìn)行離心，離心條件：轉(zhuǎn)速為12000rpm，溫度為2～8℃，時(shí)間為10min。按BCA蛋白濃度試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）說明書進(jìn)行檢測蛋白含量，總蛋白樣本加入2×Electrophoresis buffer(美國Bio Rad公司)100℃變性5min，后于-80℃保存。總蛋白采用8%～12%SDS-PAGE凝膠及垂直電泳槽進(jìn)行電泳分離，PVDF膜半干膜法轉(zhuǎn)膜，洗膜、封固、孵育一抗（按相應(yīng)抗體說明書推薦濃度采用5%BSA配置）、二抗，Chemi DOCTMMP(美國Biorad公司)蛋白印跡-多功能成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)采集及分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。研究數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)量資料比較選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05定義差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPD大鼠血清生殖激素水平比較：經(jīng)補(bǔ)腎助孕方及地屈孕酮片干預(yù)后，大鼠的血清E2及FSH水平較模型組降低，而P、LH的水平較模型組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但補(bǔ)腎助孕方組與地屈孕酮片組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如表1。

表1 生殖激素水平比較（-x±s，n=10）

2.2 LPD大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表達(dá)比較：經(jīng)補(bǔ)腎助孕方及地屈孕酮片干預(yù)后，大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表達(dá)較模型組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但補(bǔ)腎助孕方組與地屈孕酮片組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如表2。

表2 卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表達(dá)比較（-x±s）

3 討論

LPD屬于中醫(yī)學(xué)“不孕”“月經(jīng)失調(diào)”“胎漏”“胎動不安”等疾病范圍。許淑怡等[4]認(rèn)為黃體功能不全主要由于肝腎虧虛、天癸不足所致，采用調(diào)肝助癸法治療黃體功能不全性不孕癥，療效顯著。國醫(yī)大師夏桂成教授根據(jù)長期臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)LPD的病因病機(jī)主要是腎虛偏陽夾有肝郁，并獨(dú)創(chuàng)補(bǔ)腎助孕方以補(bǔ)腎助陽、佐以疏肝，用于經(jīng)前期。方中以益腎助陽的鹿角片為君藥，菟絲子平調(diào)腎中陰陽，并與具有滋陰補(bǔ)腎的懷山藥、山萸肉、炒白芍等共同組成臣藥，佐以醋柴胡以疏肝解郁和鼓舞陽氣，諸藥用于經(jīng)前期，可以使“陽長至重”，使心肝氣機(jī)得以調(diào)暢、心肝魂魄得以安定，便于更好地調(diào)控心（腦）-腎-子宮生殖軸，以利于調(diào)經(jīng)和助孕。

Kisspeptin是由KiSS-1基因編碼的一種多肽類激素，表達(dá)于卵巢，直接調(diào)控卵巢功能。研究發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin和Kiss1r均表達(dá)于嚙齒類、人類卵巢中，尤其強(qiáng)表達(dá)于成熟黃體的膜黃體和顆粒黃體細(xì)胞[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPD模型大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表達(dá)降低；與模型組比較，補(bǔ)腎助孕方組大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表達(dá)均有所上升，并且發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎助孕方組大鼠卵巢血清P較模型組大鼠升高，因此推測補(bǔ)腎助孕方可能通過上調(diào)Kisspeptin和GPR54在黃體功能不全大鼠卵巢中的表達(dá)來提高卵巢分泌P的水平，從而改善黃體功能，最終改善LPD生殖功能。

本研究結(jié)果顯示，LPD模型組大鼠血清LH水平較對照組顯著升高，與上述結(jié)論大體一致。予補(bǔ)腎助孕方和地曲孕酮片干預(yù)后，治療組和陽性對照組血清FSH水平較模型組降低，而LH的水平較模型組升高，說明補(bǔ)腎助孕方可以改善FSH、LH分泌水平。本研究顯示血清FSH、LH的水平得到糾正，提示可能是由于補(bǔ)腎助孕方上調(diào)卵巢中Kisspeptin、GPR54的表達(dá)，調(diào)整了卵巢分泌P負(fù)向介導(dǎo)HPO軸功能，從而調(diào)節(jié)FSH或LH正常分泌，并促進(jìn)子宮間質(zhì)的蛻膜樣改變和子宮內(nèi)膜從生長轉(zhuǎn)變階段進(jìn)入分泌階段，從而為胚胎植入和進(jìn)一步發(fā)展做好準(zhǔn)備，并且糾正因黃體酮分泌不足導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)育不全的狀態(tài)。而對補(bǔ)腎助孕方組與地屈孕酮片組大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表達(dá)及P、E2、FSH、LH水平進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明補(bǔ)腎助孕方具有與地屈孕酮片相同的改善LPD生殖功能的作用。

綜上所述，補(bǔ)腎助孕方可能通過Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)調(diào)節(jié)P、E2、FSH和LH分泌水平，以及卵巢中Kisspeptin、GPR54表達(dá)水平等方面改善LPD的黃體功能，促進(jìn)胚胎著床。