Alda-1通過激活線粒體乙醛脫氫酶2改善大鼠肺缺血再灌注損傷

張?jiān)?jiān)，林婷婷，夏芳芳，董嬌嬌，金周晟，劉樂

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）廣泛存在于各種臨床事件中，如肺栓塞、肺移植、體外循環(huán)術(shù)等，期間形成活性氧自由基、炎癥級聯(lián)反應(yīng)、鈣超載、細(xì)胞凋亡等一系列病生理過程，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[1]。線粒體乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是機(jī)體內(nèi)醛類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，可將有毒性的醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒性的羧酸類物質(zhì)起到解毒作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)LDH2 可減輕心[2-5]、腦[6]、肝[7-8]、腎[9]、腸[10]等臟器的缺血再灌注損傷。本研究在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，給予ALDH2 激動(dòng)劑Alda-1對LIRI進(jìn)行預(yù)處理，檢測肺病理學(xué)、醛類物質(zhì)和ALDH2，從而探求Alda-1減輕LIRI的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料健康成年SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK（浙）2015-0001。丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（硫代巴比妥酸比色法，南京建成生物工程研究所）；大鼠4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）ELISA試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司）；兔抗β-actin多克隆抗體（美國Abcam公司，貨號:ab8227），兔抗ALDH2單克隆抗體（美國Abcam公司，貨號:ab108306），ALDH2 活性比色法檢測試劑盒（美國Biovision公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及構(gòu)建大鼠LIRI模型:參考錢小英等[11]的方法復(fù)制大鼠在體LIRI模型，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠進(jìn)行分組，分為假手術(shù)組（Sham組）、肺缺血再灌注組（I/R組）和Alda-1預(yù)處理組（Alda-1組），每組8只。Sham組開胸后僅顯露左肺門，但不進(jìn)行結(jié)扎；I/R組開胸后阻斷左肺門30 min，再開放恢復(fù)供血和通氣120 min；Alda-1組于缺血前1 h腹腔注射Alda-1（6 mg/kg），其余同I/R組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取大鼠動(dòng)脈血用于測MDA及4-HNE；左肺上段置于4%中性甲醛溶液中固定，待作光鏡病理觀察；左肺中段用于肺濕干重比（W/D）測定；左肺下段用于MDA、4-HNE和ALDH2含量及活性的測定。

1.2.2 肺病理學(xué)改變:左肺上段固定后做成石蠟包塊，切片，HE染色，并在光鏡下觀察肺泡形態(tài)、結(jié)構(gòu)改變及肺間質(zhì)充血水腫等情況。

1.2.3 W/D測定:取出左肺中段組織，濾紙吸凈表面水分立即稱重并記錄濕重（W），然后置于80 ℃烘箱烘干24 h至恒重，稱干重（D），求得W/D值。

1.2.4 血漿和肺組織的MDA、4-HNE醛類物質(zhì)含量及肺組織ALDH2的活性:動(dòng)脈血離心取上層血漿，

左肺下段組織勻漿離心取上清液，根據(jù)相應(yīng)的試劑盒說明書檢測MDA、4-HNE含量及ALDH2活性。

1.2.5 Western blot檢測肺組織ALDH2蛋白相對表達(dá)量:左肺下段組織加入含1% PMSF的RIPA強(qiáng)效裂解液，勻漿提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度并配置上樣蛋白。用SDS-PAGE分離膠10%，濃縮膠5%電泳，之后采用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45 μm的PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，一抗稀釋液配制ALDH2抗體（1:1 000）和β-actin抗體（1:1 000），將膜放入相應(yīng)一抗液中4 ℃水平搖床孵育過夜，次日加入1:5 000的山羊抗兔IgG（H+L）HRP室溫孵1 h，后加入ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）自動(dòng)顯影讀取條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s 表示，3組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺病理學(xué)改變Sham組肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺間質(zhì)無明顯充血水腫；I/R組大部分肺泡被破壞，肺泡璧明顯增厚，腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞及水腫液聚集，肺間質(zhì)明顯水腫伴大量中性粒細(xì)胞浸潤；Alda-1組較I/R組，肺泡破壞程度明顯改善，腔內(nèi)僅有少量紅細(xì)胞滲出，肺間質(zhì)水腫液明顯減少（見圖1）。

2.2 W/D值與Sham組相比，I/R組的W/D值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與I/R組比較，Alda-1組的W/D值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 血漿和肺組織MDA、4-HNE醛類物質(zhì)含量的變化

I/R組的血漿和肺組織的MDA、4-HNE含量均高于Sham組（均P＜0.05）；Alda-1組的血漿和肺組織的MDA、4-HNE含量均低于I/R組（均P＜0.05），見表1。2.4 肺組織ALDH2的含量和活性變化 3組肺組織的ALDH2含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但在ALDH2活性上，I/R組低于Sham組（P＜0.05），Alda-1組顯著高于Sham組及I/R組（P＜0.05），見表2。

3 討論

肺缺血再灌注過程中產(chǎn)生的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）奪取細(xì)胞膜不飽和脂肪酸側(cè)鏈上的氫原子，啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進(jìn)而生成大量的MDA（短鏈脂肪醛類）、4-HNE（中長鏈脂肪醛類）等毒性醛類物質(zhì)。這些高活性的脂膜過氧化產(chǎn)物在體內(nèi)可通過多種途徑產(chǎn)生生物毒性，如作為內(nèi)源性誘導(dǎo)因子促進(jìn)細(xì)胞凋亡及自噬[12]，修飾含硫蛋白的相關(guān)位點(diǎn)，抑制有效蛋白生成或活性改變[13]，作為脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的聚集活化，促進(jìn)炎癥發(fā)生[14]。對于肺組織而言，在保留通氣的條件下發(fā)生缺血時(shí)，由于持續(xù)的氧氣供給，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞/炎癥細(xì)胞產(chǎn)生較其他組織器官更多的活性氧自由基，進(jìn)而形成大量的毒性醛類物質(zhì)，因此機(jī)體對于肺組織內(nèi)毒性醛類物質(zhì)的代謝就顯得尤為重要。

圖1 各組肺組織HE染色圖（×200）

表1 各組肺組織W/D及血漿肺組織MDA、4-HNE含量的比較（每組n=8±s）

表1 各組肺組織W/D及血漿肺組織MDA、4-HNE含量的比較（每組n=8±s）

與Sham組比:aP ＜0.05；與I/R組比:bP ＜0.05

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表2 各組肺組織ALDH2蛋白相對表達(dá)量及活性比較（每組n=8，±s）

表2 各組肺組織ALDH2蛋白相對表達(dá)量及活性比較（每組n=8，±s）

注:NAD為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。與Sham組比:aP＜0.05；與I/R組比:bP ＜0.05

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ALDH2是已發(fā)現(xiàn)的ALDH家族19個(gè)成員中對醛類代謝能力最強(qiáng)的同工酶，廣泛參與體內(nèi)醛類物質(zhì)的氧化反應(yīng)。近幾年關(guān)于ALDH2與肺部疾病的關(guān)系研究也越來越多，CHEN等[15]發(fā)現(xiàn)DNA堿基切除修復(fù)蛋白XRCC1高表達(dá)的肺癌患者總體存活率較差，也許與ALDH2基因低表達(dá)，減少醛類代謝有關(guān)。AU YEUNG等[16]指出ALDH2突變與肺功能呈負(fù)相關(guān)，是肺功能不佳、可能發(fā)生慢性阻塞性肺疾病的遺傳危險(xiǎn)因素。研究表明Alda-1作為一種高選擇性ALDH2小分子激動(dòng)劑[17]，可以減輕醛類誘導(dǎo)的急性肺損傷和內(nèi)皮屏障功能障礙[18-19]。

本研究顯示，I/R組的肺組織損傷嚴(yán)重，但外源性給予Alda-1 預(yù)處理后，可明顯減輕肺組織水腫、改善肺病理學(xué)變化，說明Alda-1對LIRI具有保護(hù)作用。I/R組的肺組織和血漿中堆積大量的MDA、4-HNE，而Alda-1組則改善了毒性醛類堆積的情況；但3組間的ALDH2蛋白相對表達(dá)量沒有變化，只是ALDH2的活性發(fā)生了改變，這說明肺缺血再灌注過程并沒有抑制ALDH2的合成，而是通過抑制ALDH2的活性造成醛類堆積，從而造成損傷；而Alda-1主要是通過激活A(yù)LDH2的活性，而并不是通過增加ALDH2的合成來發(fā)揮加速醛類物質(zhì)代謝的作用。