一種傷口修復(fù)密封膠的研制及性能評(píng)價(jià)

于慧光 江南大學(xué) 江蘇無錫 214000

1、傷口修復(fù)水凝膠的優(yōu)越性

為促進(jìn)開放性傷口的愈合，臨床上傳統(tǒng)采用針線縫合、密封劑密封、或者重新連接破裂組織的方式，保護(hù)和修復(fù)創(chuàng)面，達(dá)到傷口愈合的目的。但是這些方法存在一定的缺陷，如對(duì)傷口造成二次機(jī)械損傷，細(xì)胞排斥免疫，粘附性低以及在生物環(huán)境中性能不良等問題【3】。近年來，國內(nèi)外學(xué)者致力于研究具有粘性、彈性、生物相容性、無毒等優(yōu)良性狀的傷口密封水凝膠。水凝膠具有原位型促進(jìn)傷口愈合的優(yōu)點(diǎn)，因而關(guān)于該領(lǐng)域的研究在國內(nèi)外掀起了熱潮。例如，以硼酸為交聯(lián)劑制備Cur（姜黃素）/PVA（聚乙烯醇）水凝膠，能夠大規(guī)模合成，不受尺寸限制，并且能有效殺死細(xì)菌，加速大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合【4】；肽修飾殼聚糖水凝膠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，遷移和分泌以及促進(jìn)生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)進(jìn).促進(jìn)皮膚愈合【5】；由重組蛋白或白蛋白形成的用于外科手術(shù)粘合的生物粘合劑；由藻酸鹽多糖制備的傷口敷料；利用可見光固化的肝素水凝膠，不僅可以引入生長(zhǎng)因子，而且能夠減少凝膠形成時(shí)間【6】；通過光交聯(lián)重組人蛋白質(zhì)原彈性蛋白，形成具有可調(diào)粘附性能的生物相容性和高彈性水凝膠密封劑【7】。水凝膠具有三維高度水合的聚合物網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)放在溶液中時(shí)，與干重相比，可以容納多達(dá)二十至四十倍的水。由于其獨(dú)特的物理性質(zhì)，這些網(wǎng)絡(luò)可以成型或鑄造成各種大小和形狀。膠原作為天然的高親水性的多肽類高分子，是生物體內(nèi)的一種纖維蛋白，在人體中總蛋白含量中占25%-33%，大量存在于骨，軟骨和皮膚中。采用膠原作為材料具有低免疫原性，膠原雖然是大分子物質(zhì),但結(jié)構(gòu)重復(fù)性大，與其他具有免疫性的蛋白質(zhì)相比,膠原的免疫原性非常低；膠原材料另一優(yōu)勢(shì)在于它與宿主細(xì)胞及組織之間良好的相互作用即生物相容性，其可與周圍細(xì)胞表現(xiàn)出很好的相互作用，并成細(xì)胞的一部分，還可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)；膠原發(fā)達(dá)的四級(jí)結(jié)構(gòu)使其具有一定的凝血作用，可促進(jìn)血小板凝集和血漿結(jié)塊；另外膠原還具備能被蛋白酶降解的特性 ,即可生物降解性【8】。聚乙二醇（PEG）具有水溶性，并可溶于絕大多數(shù)的有機(jī)溶劑，且具有生物相容性好、無毒、免疫原性低等特點(diǎn)，并且在生物體內(nèi)可被較快代謝，通過腎排出體外，在體內(nèi)不會(huì)有積累。PEG可將其許多優(yōu)異性能賦予被修飾的物質(zhì)，作為表面修飾材料，PEG還可有效延長(zhǎng)水凝膠在體內(nèi)的半衰期【9】。在本實(shí)驗(yàn)中，采用PEGDA（聚乙二醇二丙烯酸酯）與巰基化膠原為基本材料，進(jìn)行自發(fā)交聯(lián)，形成具有一定生物粘性的水凝膠。對(duì)PEG兩端羥基進(jìn)行雙鍵修飾，得到PEGDA，其雙鍵可與巰基化膠原的巰基發(fā)生鍵合，從而發(fā)生交聯(lián)，得到具有一定粘附性和一定機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠。采用該方法所制備的水凝膠具有良好的生物相容性，無毒，并且無需引發(fā)劑可自發(fā)交聯(lián)等顯著優(yōu)點(diǎn)。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1 COL-SH 的制備【10】

將膠原（1g,0.0125mmol）溶于去離子水(150ml)中，然后用NaOH調(diào)節(jié)溶液PH=10。在4℃的條件下將琥珀酸酐（15g,0.15mol）溶于丙酮中，然后將該混合溶液滴加到膠原溶液之中。將反應(yīng)混合物的pH保持在pH9.0，并在4℃下攪拌混合物4小時(shí)。然后將該反應(yīng)溶液在去離子水中透析(MWCO=14000KDa)24h，并通過冷凍干燥收集Col-COOH產(chǎn)物.通過TNBSA測(cè)定測(cè)定的COL-COOH中剩余胺基的量為零，表明COL-COOH中羧基的DS（取代度）接近100%。將EDC(0.5g，2.6mmol)、NHS(0.3g，2.6mmol)和 MEA(0.2g，1.76mmol)的水溶液依次加入到溶在去離子水（50ml）中的Col-COOH(0.5 g,0.00625 mmol)，將反應(yīng)混合物的PH用HCL(1.0M)調(diào)節(jié)至5.5，并在室溫下攪拌混合物24h，然后用NaOH（4.0M）將溶液PH調(diào)節(jié)至8.5并用DTT（二硫蘇糖醇）（1.5g，9.7mmol）處理24h。將反應(yīng)混合物用鹽水透析24h，去離子水透析5h。凍干后，得到白色固體Col-SH。

2.2 COL-SH與PEGDA交聯(lián)成凝膠

按COL-SH:PEGDA質(zhì)量比分別為1：50、1:100、1:200進(jìn)行混合，發(fā)生自身交聯(lián)，得到半透明凝膠，將凝膠凍干后備用。

2.3 COL-SH與PEGDA交聯(lián)成凝膠

按COL-SH:PEGDA質(zhì)量比分別為1：50、1:100、1:200進(jìn)行混合，發(fā)生自身交聯(lián)，得到半透明凝膠，將凝膠凍干后備用。

2.4 溶脹實(shí)驗(yàn)（質(zhì)量分析法）【11】

將干凝膠W0浸泡于20mL PBS中（PH7.4，25℃），分別在 1min、3min、5min、10min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h稱量凝膠的質(zhì)量Wt，多余的水分用濾紙吸去，計(jì)算吸水率。

2.5 . 降解實(shí)驗(yàn)【11】

將100mg的干凝膠浸泡于含膠原蛋白酶（5U/ml）的PBS溶液中，在37℃、100rmp/min下震蕩, 4h,8h,24h在各時(shí)間點(diǎn)離心除去含有膠原蛋白酶的溶液，用PBS溶液洗滌兩次，再離心，隨后冷凍干燥。降解率根據(jù)以下公式結(jié)算計(jì)算：W0為初始干重，W1為酶解后干重。

2.6 水凝膠的微觀形態(tài)分析

使用掃描電子顯微鏡（日本日立公司 SU1510）觀察水凝膠（COL-SH:PEGDA=1：100）的的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。先將水凝膠樣品冷凍干燥。然后將其切開以觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

實(shí)驗(yàn)制備了COL（膠原）與PEGDA質(zhì)量比為1:50、1:100、1:200的水凝膠，通過水凝膠形貌、溶脹性能、水溶解性能和酶溶解性能測(cè)試證實(shí)了COL與PEGDA質(zhì)量比為1:200的水凝膠的性能整體較好。在SEM電鏡圖中，可明顯看出水凝膠具有不規(guī)則的較密的膜狀三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)不僅能夠提高水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度，而且可以很好的解釋水凝膠能夠溶脹拉伸等行為的現(xiàn)象。在溶脹實(shí)驗(yàn)中，1:200水凝膠的溶脹比較小且變化平穩(wěn)，其交聯(lián)程度最好。因?yàn)樗z的形成是由于PEGDA之間形成了凝聚纏結(jié)結(jié)構(gòu)，該纏結(jié)結(jié)構(gòu)是由PEGDA鏈間羥側(cè)基間形成的氫鍵締合結(jié)構(gòu)而引起的，其作用類似于交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)點(diǎn)。當(dāng)PEGDA濃度增加時(shí)，單位體積內(nèi)PEGDA分子數(shù)增加，形成鏈間氫鍵凝聚纏結(jié)點(diǎn)數(shù)目增加，亦即交聯(lián)度增加，故溶脹比減小。通過水溶解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)COL與PEGDA的質(zhì)量比對(duì)水凝膠的水溶解性有顯著影響，隨著PEGDA的增加可以促使水凝膠的溶解。PEGDA比例較大的水凝膠更易于與傷口融合，能更好的在體內(nèi)降解，促進(jìn)傷口的愈合。在水凝膠的酶降解曲線中，1:200水凝膠的酶降解速率最快，可見此比例的水凝膠在生物體內(nèi)能夠更好的降解，更有利于傷口的愈合與生長(zhǎng)。通過上述系列實(shí)驗(yàn)，可以認(rèn)為COL與PEGDA質(zhì)量比為1:200的水凝膠更利于促進(jìn)傷口的愈合與生長(zhǎng)，縮短傷口愈合的時(shí)間，更適合作為傷口敷料。