雷公藤甲素—甘草次酸復(fù)方微乳的制備及其理化性質(zhì)和體外釋藥特性研究

鄭恒 李曉東 翟曉瑩 董淑英 張鐸 楊瑞

摘 要 目的：建立雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的含量測(cè)定方法，優(yōu)化其處方，并考察其理化性質(zhì)及體外釋藥特性。方法：采用超高效液相色譜法測(cè)定雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的含量，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.4 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm，進(jìn)樣量為5 μL。采用水滴定法繪制偽三元相圖，以油相、表面活性劑、助表面活性劑為指標(biāo)優(yōu)化處方；采用體外釋放試驗(yàn)考察所制微乳的體外釋放特性。結(jié)果：雷公藤甲素、甘草次酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1～40 μg/mL（r=0.999 7）、10～400 μg/mL（r=0.999 8）；定量限分別為0.5、0.8 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.1、0.2 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；加樣回收率分別為100.32%～101.15%（RSD=0.36%，n=6）、99.78%～101.42%（RSD=0.59%，n=6）。最優(yōu)處方為以中鏈甘油三酯為油相，聚乙二醇羥基硬脂酸酯為表面活性劑，無(wú)水乙醇為助表面活性劑，水為水相，四者質(zhì)量比為8 ∶ 28 ∶ 14 ∶ 50。所制微乳為水包油型，外觀透明澄清，其平均粒徑為（62.38±3.44）nm，平均多分散指數(shù)為0.096±0.001，平均黏度為（26.84±1.10）mPa·S。所制微乳在24 h內(nèi)的雷公藤甲素、甘草次酸累積釋放度分別為99.8%、99.7%（pH 2.0的磷酸緩沖鹽溶液中），99.3%、99.4%（pH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液中），98.9%、98.4%（pH 9.0的磷酸緩沖鹽溶液中）；單方微乳中的雷公藤甲素和甘草次酸釋放均快于復(fù)方微乳。結(jié)論：所建含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確；所得優(yōu)化處方穩(wěn)定、可行；所制雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳較單方微乳具有更好的緩釋作用。

關(guān)鍵詞 雷公藤甲素；甘草次酸；復(fù)方微乳；超高效液相色譜法；偽三元相圖；處方優(yōu)化；體外釋放度

Study on Preparation of Triptolide-glycyrrhetic Acid Compound Microemulsion and Its Physicochemical Properties and in vitro Release Characteristics

ZHENG Heng1，LI Xiaodong1，ZHAI Xiaoying1，DONG Shuying1，ZHANG Duo1，YANG Rui2（1. Dept. of Dermatology， Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College， Shenyang 110024， China； 2. Academy of Traditional Chinese Medicine of Liaoning Province， Shenyang 110034， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish content determination method of Triptolide-glycyrrhetic acid compound microemulsion， optimize the formula and investigate its physicochemical properties and release rate in vitro. METHODS： The content of Triptolide- glycyrrhetic acid compound microemulsion was determined by UPLC. The determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 40 ℃. The detection wavelength was set at 218 nm， and sample size was 5 μL. Pseudo-ternary phase diagrams were drawn by water titration method. Using oil phase， surfactants and co-surfactants as index， the formula was optimized， and in intro release characteristics was investigated by in vitro release test. RESULTS： The linear range of triptolide and glycyrrhetinic acid were 1-40 μg/mL（r=0.999 7） and 10-400 μg/mL（r=0.999 8）， respectively. The limits of quantitation were 0.5 and 0.8 μg/mL； the limits of detection were 0.1 and 0.2 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all less than 2%. Average recoveries were 100.32%-101.15% （RSD=0.36%， n=6）， 99.78%-101.42% （RSD=0.59%，n=6）. The optimal formula included that medium chain triglyceride as oil phase， polyethylene glycol hydroxy stearate as surfactants， ethanol as co-surfactants， water as water phase， the proportion of them was 8 ∶ 28 ∶ 14 ∶ 50. The obtained microemulsion was O/W type， being transparent and clear， with average diameter， average polydispersity index and average viscosity of （62.38±3.44） nm， 0.096±0.001 and （26.84±1.10） mPa·S. Within 24 h， cumulative release rates of triptolide and glycyrrhetinic acid in obtained microemulsion were 99.8% and 99.7% （in PBS pH 2.0）， 99.3% and 99.4% （in PBS pH 7.4）， 98.9% and 98.4% （in PBS pH 9.0）， respectively. Triptolide and glycyrrhetinic acid released faster in the single microemulsion than in the compound microemulsion. CONCLUSIONS： Established content determination method is simple and stable. The optimized formula is stable and feasible. Obtained iriptolide-glycyrrhetinic acid compound microemulsion show better sustained-release effect than sigle microemulsion.

KEYWORDS Triptolide；Glycyrrhetic acid；Compound microemulsion；UPLC； Pseudo-ternary phase diagrams； Formula optimization； in vitro release rate

雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤（Tripterygium wilfordii）多年生藤本植物，味苦、辛，性寒，有劇毒，具有免疫抑制作用[1]。雷公藤?gòu)V泛應(yīng)用于血管炎[2]、紅斑狼瘡[3]、濕疹[4]、銀屑病[5]、系統(tǒng)性硬皮病[6]、過(guò)敏性紫癜[7]、結(jié)節(jié)性紅斑[8]、皮膚淀粉樣變[9]、白塞病[10]等皮膚病以及腎病[11]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[12]的治療，效果顯著。但雷公藤為有毒中藥，其活性成分雷公藤甲素具有明顯的生殖毒性[13]和肝腎毒性[14]。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，雷公藤制劑用藥后的不良反應(yīng)發(fā)生率高達(dá)11.7%[14]。古語(yǔ)云：“甘草解百毒”?，F(xiàn)代研究表明，甘草可在一定程度上拮抗雷公藤的毒性并提高療效，體現(xiàn)出了中藥配伍減毒增效的中醫(yī)藥特色優(yōu)勢(shì)[11，15]。為此，本研究將雷公藤的主要活性成分雷公藤甲素和甘草的主要活性成分甘草次酸制成雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳，以期通過(guò)配伍來(lái)降低雷公藤甲素的毒性，并利用納米制劑粒徑小、生物相容性好的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到減毒增效的目的。在此基礎(chǔ)上，筆者采用超高效液相色譜法（UPLC）測(cè)定了雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的含量，優(yōu)化其制備處方，并考察所制微乳的相關(guān)理化性質(zhì)及體外釋放度，旨在為雷公藤相關(guān)制劑的開(kāi)發(fā)以及臨床用藥安全性的提高提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLCTM型UPLC儀，包括ACQ-QSM四元泵、ACQ-FTN自動(dòng)進(jìn)樣器、ACQ二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3 色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；XW-80A型微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；XS105型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度儀（英國(guó)Malvern儀器公司）；NDJ-1 型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)（上海天平儀器廠）；透析袋（截留分子量為8 000～14 000 Da，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤甲素對(duì)照品（批號(hào)：111567-200502，純度：99.8%）、甘草次酸對(duì)照品（批號(hào)：110723-200612，純度：99.6%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；雷公藤甲素原料藥（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：130708，純度：>98.0%）；甘草次酸原料藥（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：140113，純度：>98.0%）；大豆油（營(yíng)口渤海油脂工業(yè)有限公司，批號(hào)：20121205）；油酸乙酯（北京長(zhǎng)城化學(xué)試劑廠，批號(hào)：101106）；中鏈甘油三酯（批號(hào)：111006）、辛酸/癸酸甘油三酯（批號(hào)：58653-35）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（批號(hào)：100501）、二乙二醇單乙基醚（批號(hào)：100302）均購(gòu)自法國(guó)Gattefosse公司；肉豆蔻異丙酯（批號(hào)：120612）、棕櫚酸異丙酯（批號(hào)：120908）均購(gòu)自浙江蘭溪物美化工有限公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油（批號(hào)：145179）、聚乙二醇羥基硬脂酸酯（批號(hào)：29749816K0）均購(gòu)自德國(guó)BASF公司；聚山梨酯20（批號(hào)：061016）、聚山梨酯80（批號(hào)：060409）均購(gòu)自英國(guó)CRODA公司；無(wú)水乙醇（批號(hào)：20110311）、丙二醇（批號(hào)：20090504）、聚乙二醇200（批號(hào)：20090603）、聚乙二醇400（批號(hào)：201008006）均購(gòu)自天津市百世化工有限公司；磷酸（批號(hào)：20140915）、磷酸氫二鈉（批號(hào)：20090812）、磷酸二氫鉀（批號(hào)：20120513）、氫氧化鈉（批號(hào)：20160922）、硼酸（批號(hào)：20110706）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀（北京燕京藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1507031）；亞甲藍(lán)（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：070609）；蘇丹紅Ⅲ（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司，批號(hào)：40517）；乙腈、甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的制備

精密稱取油相、表面活性劑及助表面活性劑各適量，置于具塞西林瓶中，室溫下以磁力攪拌（30 r/min，下同），混合均勻，然后加雷公藤甲素原料藥12.5 mg、甘草次酸原料藥125 mg，待完全溶解后緩慢加水50 mL，磁力攪拌1 h，即得雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳。

2.2 雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳中主成分的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，10%B→60%B；5～13 min，60%B→90%B；13～15 min，90%B）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm；進(jìn)樣量：5 μL。在該色譜條件下，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于3 000，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取雷公藤甲素對(duì)照品、甘草次酸對(duì)照品各10 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述雷公藤甲素對(duì)照品貯備液0.5 mL、甘草次酸對(duì)照品貯備液5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋制成含0.05 mg/mL雷公藤甲素、0.5 mg/mL甘草次酸的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳1 g，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的制備工藝，制備不含雷公藤甲素和甘草次酸的陰性樣品，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加流動(dòng)相稀釋制成含雷公藤甲素分別為1、2、5、10、20、40 μg/mL，甘草次酸分別為10、20、50、100、200、400 μg/mL的系列線性關(guān)系工作溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得雷公藤甲素回歸方程為y=4.023×104x-5.385×103（r=0.999 7）、甘草次酸回歸方程為y=2.683×104x+4.366×103（r=0.999 8）。結(jié)果表明，雷公藤甲素、甘草次酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1～40、10～400 μg/mL。

2.2.6 定量限與檢測(cè)限考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下各單一對(duì)照品貯備液適量，以流動(dòng)相倍比稀釋，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，雷公藤甲素、甘草次酸的定量限分別為0.5、0.8 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.1、0.2 μg/mL。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，雷公藤甲素、甘草次酸峰面積的RSD分別為0.55%、1.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、10 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，雷公藤甲素、甘草次酸峰面積的RSD分別為0.84%、0.57%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳適量，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積按回歸方程計(jì)算樣品中雷公藤甲素、甘草次酸的含量。結(jié)果，雷公藤甲素、甘草次酸的平均含量分別為0.125 2、1.245 0 mg/g，RSD分別為1.42%、1.15%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳1 g，共6份，加入一定量的各單一對(duì)照品貯備液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積按回歸方程計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取3批雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積按回歸方程計(jì)算樣品中雷公藤甲素、甘草次酸的含量。結(jié)果，雷公藤甲素的含量為0.122 7～0.126 8 mg/g、甘草次酸的含量為1.216 0～1.258 3 mg/g。

2.3 雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的處方優(yōu)化

2.3.1 油相的篩選 分別考察雷公藤甲素、甘草次酸在不同油相中的溶解度，詳見(jiàn)表2。由表2可知，雷公藤甲素、甘草次酸在中鏈甘油三酯中溶解度最高，為保證雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳中有較高的載藥量，故選擇中鏈甘油三酯為油相。

2.3.2 表面活性劑與助表面活性劑種類的篩選 分別以聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯氫化蓖麻油、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚乙二醇羥基硬脂酸酯為表面活性劑，無(wú)水乙醇為助表面活性劑，將表面活性劑和助表面活性劑按質(zhì)量比1 ∶ 1（Km值）混合后，與中鏈甘油三酯按不同質(zhì)量比（9 ∶ 1、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5、4 ∶ 6、3 ∶ 7、2 ∶ 8、1 ∶ 9）于西林瓶中混合均勻，于磁力攪拌下用水進(jìn)行滴定，同時(shí)記錄體系由混濁變?yōu)槌吻逋该鲿r(shí)的臨界點(diǎn)。按中鏈甘油三酯、混合表面活性劑、水在臨界點(diǎn)時(shí)各自的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)（w/w），繪制偽三元相圖，確定微乳的成乳區(qū)域，詳見(jiàn)圖2（圖中“ME”表示微乳成乳區(qū)域，下同）。由圖2可知，表面活性劑為聚乙二醇羥基硬脂酸酯時(shí)微乳的成乳區(qū)最大。

以聚乙二醇羥基硬脂酸酯為表面活性劑，無(wú)水乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400和二乙二醇單乙基醚為助表面活性劑，將表面活性劑和助表面活性劑按質(zhì)量比1 ∶ 1（Km值）混合后，與中鏈甘油三酯按不同質(zhì)量比（9 ∶ 1、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5、4 ∶ 6、3 ∶ 7、2 ∶ 8、1 ∶ 9）于西林瓶中混合均勻，于磁力攪拌下用水進(jìn)行滴定，同時(shí)記錄體系由混濁變?yōu)槌吻逋该鲿r(shí)的臨界點(diǎn)。按中鏈甘油三酯、混合表面活性劑、水在臨界點(diǎn)時(shí)各自的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)（w/w），繪制偽三元相圖，確定微乳的成乳區(qū)域，詳見(jiàn)圖3。由圖3可知，助表面活性劑為無(wú)水乙醇時(shí)微乳的成乳區(qū)最大。

2.3.3 表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比的確定 分別考察表面活性劑與助表面活性劑不同質(zhì)量比（Km值，1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1）對(duì)微乳形成的影響，詳見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著Km值增大，微乳成乳區(qū)增大；當(dāng)Km值大于2時(shí)，微乳成乳區(qū)變小，其原因?yàn)楫?dāng)表面活性劑與助表面活性劑為最佳質(zhì)量比時(shí)，助表面活性劑可正好完全鑲嵌到表面活性劑中，此時(shí)形成的微乳結(jié)構(gòu)中增溶空間最大、載油量最大。由此可見(jiàn)，當(dāng)Km為2時(shí)微乳成乳區(qū)大小最佳，故確定Km為2 ∶ 1。

2.3.4 最優(yōu)處方的確定 最優(yōu)處方為：表面活性劑為聚乙二醇羥基硬脂酸酯，助表面活性劑為無(wú)水乙醇，油相為中鏈甘油三酯，水相為純水，四者質(zhì)量比為28 ∶ 14 ∶ 8 ∶ 50。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述最優(yōu)處方，平行制備3批雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳，依法測(cè)定主成分含量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，最優(yōu)處方穩(wěn)定、可行。

2.4 雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的理化性質(zhì)考察

2.4.1 外觀 按最優(yōu)處方制備所得雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳為透明澄清的液體。

2.4.2 微乳類別 采用染色法[16]鑒別微乳的類別。按最優(yōu)處方制備雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳2批，分別加蘇丹紅Ⅲ染料和亞甲藍(lán)染料，靜置24 h，肉眼觀察染料在微乳中的擴(kuò)散速度。結(jié)果，微乳中藍(lán)色染料（水溶性）的擴(kuò)散速度大于紅色染料（油溶性）。由此判定，雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳為水包油型微乳。

2.4.3 粒徑 按最優(yōu)處方制備雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳3批，加水稀釋至一定濃度，采用激光粒度儀測(cè)定其粒徑。結(jié)果，雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的平均粒徑為（62.38±3.44）nm，多分散指數(shù)為0.096±0.001，表明該微乳粒徑小且分布均勻。

2.4.4 黏度 按最優(yōu)處方制備雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳3批，于25 ℃采用黏度計(jì)測(cè)定其黏度。結(jié)果，雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的平均黏度為（26.84±1.10）mPa·s。

2.5 雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的體外釋藥試驗(yàn)

采用透析法[17]進(jìn)行體外釋藥試驗(yàn)。取雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳2 g，放入經(jīng)處理的透析袋中，扎緊透析袋兩端，將透析袋放入含有1%聚山梨酯80的釋放介質(zhì)[pH 2.0的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（模擬胃液環(huán)境）、pH 7.4的PBS（模擬結(jié)腸環(huán)境）、pH 9.0的PBS（模擬大腸環(huán)境）]100 mL中。另取與雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳濃度相同的雷公藤甲素混懸液、甘草次酸混懸液、不含甘草次酸的雷公藤甲素微乳及不含雷公藤甲素的甘草次酸微乳作為對(duì)照。設(shè)定溫度（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)充同溫度、等體積的新鮮釋放介質(zhì)。樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算藥物累積釋放度，以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)、藥物累積釋放度（%）為縱坐標(biāo)，繪制釋放曲線，詳見(jiàn)圖5。結(jié)果，24 h內(nèi)，雷公藤甲素、甘草次酸的累積釋放度分別為99.8%、99.7%（pH 2.0的PBS中），99.3%和99.4%（pH 7.4的PBS中），98.9%、98.4%（pH 9.0的PBS中），相比于單方微乳具有緩釋作用。

將雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳的體外釋放數(shù)據(jù)分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi 方程和Weibull 方程進(jìn)行擬合。結(jié)果顯示，雷公藤甲素在pH 2.0的PBS中釋放符合Weibull方程，在pH 7.4、pH 9.0的PBS中的釋放均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程；甘草次酸在pH 2.0、pH 7.4、pH 9.0的PBS中釋放均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，詳見(jiàn)表4。

3 討論

甘草具有清熱解毒、止咳祛痰、補(bǔ)脾和胃、調(diào)和諸藥的功效[18]。甘草解毒作用最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“倍力氣，金瘡腫，解毒”[19]；《本草綱目》中也有記載：“諸藥中甘草為君，治七十二種乳石毒，解一千二百種草木毒”[19]；《千金方》記載：“解百草毒，如湯沃雪，甘草入腹即定，驗(yàn)如反掌”，故有“國(guó)老”之號(hào)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，甘草解毒的主要活性成分為甘草甜素及其水解產(chǎn)生的甘草次酸和葡萄糖醛酸[19]。甘草中的活性成分可與毒性化合物形成絡(luò)合物[21]發(fā)揮腎上腺皮質(zhì)激素樣作用[22]、緩解中毒癥狀[23]、抗微生物毒素[24]、誘導(dǎo)P糖蛋白表達(dá)等功能[25]。甘草次酸為甘草酸的水解產(chǎn)物，是甘草的主要藥效成分，具有抗過(guò)敏[26]、免疫調(diào)節(jié)[27]、抗腫瘤[28]、解毒保肝[29]、抗氧化[30]等作用，臨床常用其替代激素類藥物治療免疫類疾病、癌癥，與其他藥物聯(lián)用可有效治療神經(jīng)性皮炎、慢性濕疹、慢性蕁麻疹、斑禿等皮膚疾病[31]。

微乳是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按一定比例混合制成的均勻、透明、各向同性和熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體系。微乳處方中親脂性成分比例較大，具有良好的生物相容性，加之粒徑小、比表面積大、吸收迅速完全，因此具有廣闊的研發(fā)前景[17]。

本研究采用UPLC法測(cè)定雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳中雷公藤甲素和甘草次酸的含量，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好。另外，通過(guò)雷公藤甲素和甘草次酸在不同油相中的溶解度，確定了中鏈甘油三酯為油相；通過(guò)偽三元相圖成乳區(qū)域大小確定了聚乙二醇羥基硬脂酸酯為表面活性劑、無(wú)水乙醇為助表面活性劑，且Km為2 ∶ 1時(shí)微乳成乳區(qū)域最大。最終確定最優(yōu)處方為表面活性劑為聚乙二醇羥基硬脂酸酯，助表面活性劑為無(wú)水乙醇，油相為中鏈甘油三酯，水相為水，四者質(zhì)量比為28 ∶ 14 ∶ 8 ∶ 50。以此處方制得微乳的外觀透明澄清、粒徑均勻。

體外釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示，單方微乳中2種主成分的釋放速度均快于復(fù)方微乳，推測(cè)原因可能為雷公藤甲素與甘草次酸形成了絡(luò)合物，使釋放速度減慢，而達(dá)到減毒的功效。此外，基于甘草次酸的抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)作用，本研究制備的雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳可在免疫性疾病的治療中起到雙重調(diào)節(jié)作用，具有減毒增效的雙重作用[30]，為有毒中藥的臨床應(yīng)用提供了新的研究思路。

綜上所述，本研究所建含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，所得優(yōu)化處方穩(wěn)定、可行，所制雷公藤甲素-甘草次酸復(fù)方微乳較單方微乳具有更好的緩釋作用。

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（收稿日期：2019-01-04 修回日期：2019-04-27）

（編輯：陳 宏）