兩種方法提取氣滯胃痛顆粒方中枳殼與香附總揮發(fā)油的效果比較

鄭鵬 趙昭 頓佳穎 李佳佳 李春花

摘 要 目的：比較水蒸氣蒸餾法（SD）與提取-共沸精餾耦合技術(shù)（WER）提取枳殼、香附總揮發(fā)油的效果，確定更優(yōu)提取方法，以改善氣滯胃痛顆粒劑中揮發(fā)性成分的提取工藝。方法：分別采用SD法與WER法提取枳殼、香附的總揮發(fā)油，對兩種方法所提取揮發(fā)油的得率進(jìn)行配對t檢驗；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對兩種方法所提取總揮發(fā)油進(jìn)行分析，明確其主要成分，并采用面積歸一化法測定并比較主要成分的相對含量。GC-MS分析采用色譜柱為Agilent HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為氮氣，流速為1 mL/min，分流比為20 ∶ 1，進(jìn)樣量為2 μL，程序升溫，電轟擊離子源，電子轟擊能量為70 eV，掃描范圍質(zhì)荷比范圍為50～500。結(jié)果：WER法所提揮發(fā)油顏色更加清澈，品相優(yōu)于SD法提取揮發(fā)油，總揮發(fā)油的平均得率顯著高于SD法（1.78% vs. 1.48%，P<0.01）；WER法與SD法所提取總揮發(fā)油中分別含39、38個成分，共有成分為38個。其中，D-檸檬烯、香附子烯、香附烯酮和α-香附酮為枳殼、香附總揮發(fā)油的主要成分，這4個成分共分別約占總成分的73.40%（WER法）和68.46%（SD法）。結(jié)論：相比于SD法，WER法提取枳殼、香附總揮發(fā)油的品相更好、得率更高、有效成分的含量更高，更適用于氣滯胃痛顆粒劑中揮發(fā)性成分的提取。

關(guān)鍵詞 提取-共沸精餾耦合技術(shù)；水蒸氣蒸餾法；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；枳殼；香附；揮發(fā)油

Comparison of the Extraction Effects of Two Methods on the Total Volatile Oil from Citrus aurantium and Cyperus rotundus in Qizhi Weitong Granule

ZHENG Peng1，ZHAO Zhao2，DUN Jiaying1，LI Jiajia1，LI Chunhua1（1. College of Pharmacy， Hebei University of TCM， Shijiazhuang 050090， China； 2. Hebei Provincial Library， Shijiazhuang 050011， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To compare the extraction effects of steam distillation method （SD） and extraction-azeotropic distillation coupling technology （WER） on the volatile oil from Citrus aurantium and Cyperus rotundus， so as to determine the suitable extraction method and improve the extraction technology of volatile components in Qizhi weitong granule. METHODS： SD and WER were used to extract the total volatile oil from C. aurantium and C. rotundus. t-test was conducted for the yield of volatile oil extracted by the two methods. GC-MS method was used to analyze the volatile oil， and the main components were determined. The relative content of main components was determined compared by area normalization method. GC-MS conditions included that Agilent HP-5 capillary column （30 m×0.25 mm ， 0.25 μm）， inlet temperature of 250 ℃， nitrogen as carrier gas， flow rate of 1 mL/min， split ratio of 20 ∶ 1， sample size of 2 μL， temperature programmed， electron bombardment， electron bombardment energy of 70 eV， scanning range of m/z 50-500. RESULTS： The appearance of volatile oil extracted by WER was more clear， with better product phase than that by SD. The average yield of volatile oil extracted by WER method were significantly higher than SD method （1.78% vs. 1.48%， P<0.01）. The volatile oil extracted by WER method and SD method contained 39 and 38 components， involving 38 common components. Among them， D-limonene， acetophenone， ketoenone and α-ketone were the main components of the total volatile oil from C. aurantium and C. rotundus， and the sum of the 4 main components was about 73.40% （WER method） and 68.46% （SD method） of the total components. CONCLUSIONS： Compared with SD method， WER method for extracting volatile oil from C.aurantium and C. rotundus is better in product， phase higher in yield and higher in content of active volatiles， and is more suitable for the extraction of volatile components in Qizhi weitong granule.

KEYWORDS WER； SD； GC-MS； Citrus aurantium； Cyperus rotundus； Volatile oil

氣滯胃痛顆粒劑收載于2015年版《中國藥典》（一部），其由柴胡、枳殼、白芍、甘草、香附、延胡索組成[1]。方中，柴胡疏肝解郁、理氣止痛，為君藥；香附疏肝理氣、行氣止痛，白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，共為臣藥；延胡索活血行氣、止痛，枳殼行氣和中、消痞除脹，共為佐藥；炙甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥，為佐使藥；全方合用，具有舒肝理氣、和胃止痛之功效，臨床用于肝郁氣滯、胸痞脹滿、胃脘疼痛等證[2]。方中揮發(fā)性成分主要來源于枳殼、香附[3]，是氣滯胃痛顆粒劑發(fā)揮療效的主要藥效成分之一[3-5]，其中枳殼揮發(fā)油具有理氣、行滯、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等作用[4]，香附揮發(fā)油具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等作用[5]?！吨袊幍洹返闹品椋喝¤讱ぁ⒋紫愀教崛]發(fā)油，揮發(fā)油及水提液備用；其余柴胡等4味藥材加水煎煮2次，合并水煎液并與枳殼、醋香附的水提液合并；濾過，濾液濃縮至相對密度為1.18～1.23（50 ℃）的清膏，加蔗糖和糊精適量，制成顆粒，噴入揮發(fā)油，混勻，即得[1]。由此可見，枳殼、香附揮發(fā)油的提取效果影響著該制劑的整體質(zhì)量及后續(xù)臨床療效，而有效的提取方法和工藝是揮發(fā)油質(zhì)量和臨床療效的保證，因此總揮發(fā)油的高效提取對于氣滯胃痛顆粒劑的開發(fā)利用具有重要意義。水蒸氣蒸餾法（SD）為常用的揮發(fā)油提取方法，收載于2015年版《中國藥典》（四部）[6]中。SD法是有效提取中藥揮發(fā)油的重要方法，具有設(shè)備簡單、操作安全、不污染環(huán)境、成本低等特點，但SD法在生產(chǎn)過程中常存在揮發(fā)油品相差、易乳化、提取率普遍較低等問題[7]。有研究提出，可應(yīng)用提取-共沸精餾耦合技術(shù)（WER）代替SD法提取中藥揮發(fā)油，該法保留了SD法優(yōu)點的同時，具有揮發(fā)油品相好、不易乳化、能有效提高水溶性較強(qiáng)揮發(fā)油的提取率等特點[8]?；诖?，本試驗分別應(yīng)用SD法和WER法提取氣滯胃痛顆粒劑中枳殼和香附的總揮發(fā)油，并從揮發(fā)油得率及主要成分兩方面對提取效果進(jìn)行對比研究，以確定氣滯胃痛顆粒劑中揮發(fā)性成分的最佳提取方法，以改善其制劑工藝。

1 材料

1.1 儀器

5977型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）（美國Agilent公司）；SPH-300A型氫氣發(fā)生器、SPB-3型全自動空氣源（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；24/29標(biāo)口塞5 mL量管揮發(fā)油測定器（相對密度小于1.0） 、Φ45×5×800 mm精餾柱 （上海玻璃儀器廠 ）。

1.2 藥材與試劑

枳殼（湖南省益陽市沅江市，2018年7月采集，批號：16081801）、香附（湖北省黃岡市羅田縣，2018年7月采集，批號：16120301）藥材經(jīng)河北省藥品檢驗研究院孫寶惠教授鑒定，枳殼為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培變種的干燥未成熟果實，香附為莎草科植物莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根莖。甲醇為色譜純，乙醇為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取

2.1.1 預(yù)試驗 按處方比例[6]稱取枳殼、香附藥材各50 g，粉碎過篩后置于圓底燒瓶中，加水沒過藥材，連接揮發(fā)油提取器，加熱提取至揮發(fā)油提取器中油量不再增加。結(jié)果顯示，在提取過程中兩種揮發(fā)油不存在分層現(xiàn)象，表明枳殼揮發(fā)油與香附揮發(fā)油密度相近，可同時提取。

2.1.2 SD法提取 按組方比例[6]稱取枳殼、香附藥材各50 g，參照2015年版《中國藥典》（四部）“揮發(fā)油測定法”甲法[6]，選用河北中醫(yī)學(xué)院李春花教授課題組前期優(yōu)選的SD法最佳提取工藝進(jìn)行揮發(fā)油提取，平行提取3次，計算揮發(fā)油得率及其平均值。揮發(fā)油性狀及得率見表1。

2.1.3 WER法提取 按組方比例[6]稱取枳殼、香附藥材各50 g，選用李春花教授課題組前期優(yōu)選的WER法最佳提取工藝進(jìn)行揮發(fā)油提取，平行提取3次，計算揮發(fā)油得率及其平均值。揮發(fā)油得率及性狀見表1。

2.2 GC-MS分析揮發(fā)油成分

2.2.1 供試品溶液的制備 按“2.1”項下兩種方法分別提取枳殼、香附總揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，以3 000 r/min離心5 min后，取0.1 mL置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解、定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 GC-MS條件 （1）GC條件。色譜柱：Agilent HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：氮氣（N2，純度：99.99%）；流速：1 mL/min；分流比：20 ∶ 1；進(jìn)樣量：2 μL；程序升溫（初始溫度60 ℃，以2 ℃/min速度升至210 ℃，再以10 ℃/min速度升至300 ℃，在300 ℃保持5 min）。（2）MS條件[9-10]。離子源：電轟擊離子源；電子轟擊能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；檢測器溫度：280 ℃；加速電壓：34.6 V；分辨率：2 500；倍增器電壓：1 388 V；四極桿溫度：150 ℃；掃描范圍：質(zhì)荷比（m/z）50～500；掃描數(shù)：4.45次/s。SD法和WER法提取的揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖見圖1。在NIST MS Search 2.0質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)中檢索，查詢化學(xué)物質(zhì)登錄號（CAS），記錄樣品各組分并采用面積歸一化法計算其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)[4，11]，結(jié)果見表2。

2.3 WER法與SD法提取枳殼、香附總揮發(fā)油的效果比較

2.3.1 品相比較 經(jīng)對比，WER法與SD法所提枳殼、香附總揮發(fā)油均為黃色油狀液體，但WER法所提揮發(fā)油的顏色更加清澈，SD法所提取揮發(fā)油比較渾濁，前者所提揮發(fā)油品相更好。

2.3.2 得率比較 采用SPSS 16.0軟件對表1中兩種方法所提取的5組揮發(fā)油得率進(jìn)行配對t檢驗，結(jié)果顯示其均值為0.300 00、標(biāo)準(zhǔn)差為0.035 36、均值的標(biāo)準(zhǔn)誤為0.015 81、差分的95%置信區(qū)間為0.256 10～0.343 90，t=18.974，P<0.01，表明兩組數(shù)據(jù)之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，SD法所得揮發(fā)油得率顯著低于WER法。

2.3.3 主要成分比較 由圖1及表2可知，SD法與WER法所提取的總揮發(fā)油中分別含38、39種成分，共有成分為38個。在38個共有成分中，D-檸檬烯、香附子烯、香附烯酮和α-香附酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，4個成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和分別占總成分的68.46%（SD法）和73.40%（WER法），是枳殼、香附總揮發(fā)油的主要成分。WER法所提取揮發(fā)油中，采集時間為34.580 min時出現(xiàn)的峰是唯一一個非共有峰，經(jīng)查詢?yōu)槲粗煞?，且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.29%。分別對比SD法與WER法所提枳殼、香附總揮發(fā)油中4種主要成分含量：SD法提取的D-檸檬烯、香附子烯、香附烯酮和α-香附酮的采集時間分別為9.186、22.088、29.350、30.522 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為32.30%、6.70%、15.28%、14.18%；WER法提取的4種成分的采集時間分別為9.202、22.090、29.355、30.522 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為34.62%、7.47%、16.75%、14.56%，說明采用WER法所得總揮發(fā)油中D-檸檬烯、香附子烯、香附烯酮和α-香附酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于SD法。在圖1中提取上述4種成分的離子流圖，詳見圖2。

3 討論

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，關(guān)于中藥揮發(fā)油提取研究多采用SD法、超臨界萃取法（SFE）及其比較研究[12-13]等，而應(yīng)用WER法提取中藥揮發(fā)油并與SD法進(jìn)行比較研究的報道較少。對SD法和SFE法提取中藥揮發(fā)油的比較研究表明，SFE法雖可提升中藥揮發(fā)油的提取率，但對揮發(fā)油的成分也會造成很大影響[12]。河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李春花教授課題組前期基于響面法與信息熵原理，以揮發(fā)油得率、揮發(fā)油中各有效成分含量的綜合評分為評價指標(biāo)優(yōu)選了SD法與WER法提取枳殼、香附總揮發(fā)油的最佳提取工藝。結(jié)果，SD法提取枳殼、香附總揮發(fā)油最佳提取工藝為液料比13.773 g/mL、浸泡時間1.105 h、提取時間6.767 h，綜合評分為0.925；WER法最佳提取工藝為液料比13.218 g/mL、浸泡時間1.129 h、提取時間6.515 h，綜合評分為0.938（擬另文發(fā)表）。由此可見，WER法最佳提取工藝對應(yīng)綜合評分高于SD法，且所需液料比更少、提取時間更短。SD法提取裝置主要由水蒸氣發(fā)生裝置、蒸餾裝置、冷凝裝置和接收裝置等4個部分組成，其在提取一些揮發(fā)油時，除收集油相中所得揮發(fā)油外，對殘留蒸餾水進(jìn)行二次回流亦可收集少量揮發(fā)油，并不能一次性有效地提取水溶性較強(qiáng)的揮發(fā)油[14]。揮發(fā)油的提取分為固-液傳質(zhì)平衡、液-氣傳質(zhì)平衡、氣-液傳質(zhì)平衡及液-液傳質(zhì)平衡4個過程[15]。WER法在SD法裝置基礎(chǔ)上加入了特制的精餾塔，其在提取揮發(fā)油時，與水互溶的揮發(fā)性成分隨水蒸氣進(jìn)入精餾塔，塔中的填料使得氣、液兩相逆流多級接觸，可利用混合物中各組分相對揮發(fā)度的差異， 在濃度差驅(qū)動和相平衡關(guān)系的約束下，使易揮發(fā)組分不斷從液相往氣相遷移，而難揮發(fā)組分由氣相向液相遷移，使混合液體在精餾塔中連續(xù)或多次部分汽化與冷凝，從而完成多次氣-液傳質(zhì)過程[14-15]。相比于SD法僅一次氣-液傳質(zhì)平衡過程，WER法的多次氣-液傳質(zhì)過程使得氣相中揮發(fā)性成分濃度增高、油水之比越高，故其冷凝后在冷凝液中的濃度越高，富集得到的揮發(fā)油也就越多。

現(xiàn)代藥理研究表明，D-檸檬烯具有鎮(zhèn)痛、抑菌、消炎、預(yù)防和治療癌癥的作用，為枳殼揮發(fā)油的主要有效成分[16]；香附子烯、α-香附酮和香附烯酮具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抑制子宮收縮等作用，是香附揮發(fā)油的主要有效成分[17]。所提枳殼、香附總揮發(fā)油中4種有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低直接影響著氣滯胃痛顆粒劑的治療作用。本試驗對采用SD法與WER法最佳提取工藝提取的枳殼、香附總揮發(fā)油品相、得率及所含主要有效成分的含量進(jìn)行對比，結(jié)果表明，應(yīng)用WER法提取的枳殼、香附總揮發(fā)油顏色更加清澈，品相、得率顯著優(yōu)于/高于SD法；同時，GC-MS分析結(jié)果表明，在所提枳殼、香附總揮發(fā)油組成成分上，WER法與SD法并無明顯區(qū)別，但WER減緩所提揮發(fā)油中4種主要有效成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于SD法。但在試驗過程中筆者發(fā)現(xiàn)，與SD法比較，應(yīng)用WER法時，從圓底燒瓶中溶劑沸騰到接收裝置收集到揮發(fā)油的時間明顯增加約30 min，這是由于精餾塔的存在增加了蒸餾裝置同冷凝裝置間的距離造成的。

綜上所述，相比于SD法，WER法提取枳殼、香附總揮發(fā)油的品相更好、得率更高、有效成分的含量更高，更適用于氣滯胃痛顆粒劑中揮發(fā)性成分的提取，可為改善該顆粒劑的制劑工藝提供參考。

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（收稿日期：2018-11-07 修回日期：2019-02-20）

（編輯：余慶華）