IL-1RA對COPD模型大鼠氣道炎癥和氣道重塑的保護作用

劉菁 魏風(fēng)芹 趙偉業(yè)

[摘要] 目的 探討白細胞介素1受體拮抗劑（IL-1RA）對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型大鼠氣道炎癥和氣道重塑的保護作用。 方法 采用煙熏加氣管內(nèi)注射脂多糖（LPS）對30只Wistar大鼠造模，并采用隨機數(shù)字表法將其分為對照組、甲潑尼龍治療組、IL-1RA治療組，每組10只。于第20天開始對各組大鼠連續(xù)干預(yù)20 d，其中對照組注射生理鹽水0.5 mg/（kg·d），甲潑尼龍治療組注射甲潑尼龍0.5 mg/（kg·d），IL-1RA治療組皮下注射IL-lRA 100 pg/只。觀察各組大鼠外觀、測量血氣，進行肺組織病理學(xué)檢查并計算平均肺泡數(shù)（MAN）和肺平均內(nèi)襯間隔（MLI）;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）含量;采用Western blot法檢測各組大鼠肺組織中HMGB1的表達。 結(jié)果 治療后，三組大鼠MAN、MLI比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其中IL-1RA治療組MAN大于甲潑尼龍治療組和對照組（P < 0.05），且其MLI明顯小于甲潑尼龍治療組和對照組（P < 0.05）。三組大鼠BALF和肺組織中HMGB1表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其中IL-1RA治療組BALF中HMGB1表達量低于甲潑尼龍治療組和對照組（P < 0.05）;且其肺組織中HMGB1表達量低于甲潑尼龍治療組和對照組（P < 0.05）。 結(jié)論 IL-RA可以降低COPD大鼠模型肺組織和肺泡中HMGB1的表達，降低大鼠氣道炎癥，改善大鼠血氣功能，對氣道重塑具有保護作用。

[關(guān)鍵詞] 慢性阻塞性肺疾病;白細胞介素1受體拮抗劑;高遷移率族蛋白B1;炎癥;氣道重塑

[中圖分類號] R563.9? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（b）-0021-05

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of interleukin-1 receptor antagonist （IL-1RA） on airway inflammation and airway remodeling in rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. Methods Thirty Wistar rats were induced by smoking and intratracheal injection of lipopolysaccharide （LPS）. They were divided into control group， methylprednisolone treatment group and IL-1RA treatment group according to random number table method， with 10 rats in each group. Rats in each group were continuously intervened for 20 days starting on the 20th day. The control group was injected with 0.5 mg/（kg·d） saline， the methylprednisolone treatment group was injected with 0.5 mg/（kg·d） methylprednisolone， and the IL-1RA treatment group was subcutaneously injected with IL-lRA l00 pg per rat. The appearance of rats in each group was observed， blood gas was measured， lung histopathological examination was carried out， and mean alveolar number （MAN） and mean lining interval （MLI） were calculated. The content of High mobility group protein B1 （HMGB1） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of rats in each group was detected by enzyme-linked immunosorbent assay， and the expression of HMGB1 in lung tissue of rats in each group was detected by Western blot. Results After treatment， there were significant differences in MAN and MLI among the three groups （P < 0.05）. MAN in IL-1RA group was higher than that in methylprednisolone group and control group （P < 0.05）， and MLI in IL-1RA group was significantly lower than that in methylprednisolone group and control group （P < 0.05）. The expression of HMGB1 in BALF and lung tissue of three groups was significantly different （P < 0.05）. The expression of HMGB1 in BALF of IL-1RA group was lower than that of methylprednisolone group and control group （P < 0.05）， and the expression of HMGB1 in lung tissue was lower than that of methylprednisolone group and control group （P < 0.05）. Conclusion IL-RA can reduce the expression of HMGB1 in lung tissue and alveoli of COPD rats， reduce airway inflammation， improve blood gas function and protect airway remodeling.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease; Interleukin-1 receptor antagonist; High mobility group protein B1; Inflammation; Airway remodeling

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）在40歲以上人群中發(fā)病率高達10%左右[1]。大多數(shù)COPD患者多合并其他慢性疾病，這導(dǎo)致COPD患者死亡率較高[2]。目前認為持續(xù)性氣流受限為COPD的特征表現(xiàn)，而氣道炎癥和氣道重塑是疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[3]。COPD發(fā)病涉及多種復(fù)雜機制，白細胞介素-1（IL-1）家族在炎癥和氣道重塑中發(fā)揮著重要作用[4]。白細胞介素1受體拮抗劑（IL-1RA）作為IL-1的天然拮抗劑越來越受到重視，然而IL-1RA能否改善COPD患者的氣道炎癥和氣道重塑情況仍未完全明確[5]。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是巨噬細胞釋放的核蛋白，已經(jīng)證實其在COPD晚期炎性反應(yīng)中發(fā)揮著巨大作用[6]。本研究通過觀察IL-1RA治療后COPD模型大鼠氣道的和氣管中HMGB1變化探索IL-1RA的保護作用，以期明確IL-1R對大鼠氣道炎癥和氣道重塑效果，為臨床治療和藥物研發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

重組大鼠白介素1受體拮抗劑（ProSpec-Tany公司，批號：CYT-152）;HMGB1檢測試劑盒（Mabtech公司），泰山（宏圖）軟包香煙（山東中煙工業(yè)公司）。其他試劑來自市售分析純。

有機玻璃熏箱（北京呼吸病研究所）;ZS-2型板式酶標(biāo)儀（南昌高騰科技有限公司）;OLYMPUS-CH顯微鏡;OLYMPUS-BH2顯微照相儀;OLYMPUS圖像分析儀。

1.2 分組及干預(yù)方法

選取Wistar雄性大鼠30只[購自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院（以下簡稱“我院”）實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）20150003]。適應(yīng)喂養(yǎng)7 d，采用隨機數(shù)字表法將其分為對照組、甲潑尼龍治療組、IL-1RA治療組，每組10只。模型構(gòu)建：于第1、14天向大鼠氣管內(nèi)分2次滴注0.1%的脂多糖溶液200 μL;于第2～13天、第15～40天給與大鼠被動吸煙方法：有機玻璃箱內(nèi)同時熏香煙2支，自然熄滅后再換2支，每次10支，保持箱內(nèi)氣壓與外界相等，間隔4 h后再重復(fù)上述煙熏1次[7]。本研究經(jīng)我院實驗動物倫理委員會審核。

于第20天開始對各組大鼠采用下列干預(yù)方法：①對照組注射生理鹽水0.5 mg/（kg·d），連續(xù)20 d;②甲潑尼龍治療組注射甲潑尼龍0.5 mg/（kg·d），連續(xù)20 d;③IL-1RA治療組皮下注射IL-1RA l00 pg/只，連續(xù)20 d。完成上述干預(yù)后，次日觀察各組動物的一般情況。

1.3 血氣和支氣管肺泡灌洗液檢查

大鼠腹腔注射麻醉后，抽取0.5 mL動脈血檢測血氣。后暴露心肺，生理鹽水分3次注入大鼠左肺組織，每次注入量分別為4、3、2 mL，于氣道內(nèi)反復(fù)注入回抽3次，灌洗后立即回收，回收率>85%，將支氣管肺泡灌洗液（BALF）置離心管中，4℃貯存，1 h內(nèi)離心。

1.4 肺組織病理學(xué)檢測

分離大鼠肺臟組織，沖洗后取左肺中葉組織，HE染色。應(yīng)用顯微-微機圖像處理系統(tǒng)，10倍物鏡下沿切片最大橫徑和最大縱徑，測量平均肺泡數(shù)（MAN）和肺泡平均內(nèi)襯間隔（MLI）。其中，MAN=視野內(nèi)肺泡數(shù)÷視野面積;MLI=視野正中劃“+”字交叉線長度÷與“+”字相交肺泡隔數(shù)，以MLI反映肺泡的平均直徑。

1.5 HMGB1檢測

采用Western blot法檢測各組大鼠肺組織中HMGBl的表達，使用Image J軟件分析其差異。按酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELSIA）檢測試劑盒操作說明對BALF中HMGB1進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外觀及肺組織病理學(xué)比較

造模后，IL-1RA治療組大鼠體重（193.73±6.52）g、甲潑尼龍治療組大鼠體重（192.57±8.72）g、對照組（189.64±7.25）g，三組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F = 2.714，P > 0.05）。此外，對照組大鼠較其他兩組毛發(fā)更灰暗，自發(fā)活動減少。

對照組大鼠支氣管黏膜上皮細胞紊亂、減少，纖毛粘連，杯狀細胞增生，可見支氣管血管平滑肌增生，周圍見中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，肺泡壁變薄，部分存在斷裂、融合，肺泡直徑增大，肺大泡顯而易見，肺泡內(nèi)存在紅細胞、滲出物和壞死上皮，存在COPD特征性病理學(xué)特征，提示造模成功。IL-1RA治療組和甲潑尼龍治療組中大鼠鏡下仍有上述COPD特征病理改變，但兩組大鼠的支氣管黏膜壞死、杯狀細胞增生、炎癥細胞浸潤、肺泡腔內(nèi)脫落壞死滲出物較對照組明顯減少。見圖1。

2.2 各組大鼠內(nèi)平均肺泡數(shù)和肺平均內(nèi)襯間隔比較

三組MAN、MLI比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。其中IL-1RA治療組MAN大于甲潑尼龍治療組和對照組（P < 0.05），甲潑尼龍治療組大于對照組（P < 0.05）;IL-1RA治療組MLI明顯小于甲潑尼龍治療組和對照組（P < 0.05），甲潑尼龍治療組小于對照組（P < 0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠動脈血氣結(jié)果比較

三組pH、PaO2、PaCO2比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。其中，各組pH兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;IL-1RA治療組PaO2高于甲潑尼龍治療組和對照組（P < 0.05），甲潑尼龍治療組高于對照組（P < 0.05）;IL-1RA治療組PaCO2低于甲潑尼龍治療組和對照組（P < 0.05），甲潑尼龍治療組低于對照組（P < 0.05）。見表2。

[6]? 侯嘉，馬偉榮，劉潔，等.慢性阻塞性肺疾病患者肺組織和血清HMGB1的表達及與TNF-α和IL-1β的相關(guān)性[J].中國老年學(xué)雜志，2014（18）：5064-5066.

[7]? 宋一平，崔德健，茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)的影響[J].中華內(nèi)科雜志，2000，39（8）：556-557.

[8]? 劉成，胡俊鋒.COPD急性加重危險因素的研究進展[J].國際呼吸雜志，2017，37（7）：520-526.

[9]? Pera T，Zuidhof AB，Smit M，et al. Arginase inhibition prevents inflammation and remodeling in a guinea pig model of chronic obstructive pulmonary disease [J]. J Pharmacol Exp Ther，2014，349（2）：229-238.

[10]? 周新.慢性阻塞性肺病急性加重的診斷與藥物治療進展[J].臨床肺科雜志，2007，12（4）：319-320.

[11]? 肖芹.納洛酮輔助無創(chuàng)正壓通氣治療對穩(wěn)定期COPD患者肺功能、動脈血氣指標(biāo)及心率的影響[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2018，13（5）：554-559.

[12]? 李進勇，曾瑋.沙美特羅氟替卡松對急性加重期COPD患者骨代謝以及氣道重塑的影響分析[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，16（14）：1406-1410.

[13]? 柯華，陳維永.吸入糖皮質(zhì)激素對慢性阻塞性肺疾病患者肺癌發(fā)生風(fēng)險影響的系統(tǒng)評價[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2018，13（4）：467-472.

[14]? 包明紅，梅曉冬.慢性阻塞性肺疾病急性加重期聯(lián)合吸入藥物治療的臨床研究[J].臨床肺科雜志，2011，16（7）：1018-1020.

[15]? 孫惠萍，徐惠娟，戴加樂.糖皮質(zhì)激素不同給藥方式對急性加重期慢性阻塞性肺疾病治療的有效性和安全性[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（1）：130-132.

[16]? 于婧，袁雅冬.白介素1受體拮抗劑與呼吸系統(tǒng)疾病[J].國際呼吸雜志，2010，30（11）：697-704.

[17]? Wahab F，Santos-Junior NN，de Almeida Rodrigues RP，et al. Interleukin-1 Receptor Antagonist Decreases Hypothalamic Oxidative Stress During Experimental Sepsis [J]. Mol Neurobiol，2016，53（6）：3992-3998.

[18]? Jones RL，Noble PB，Elliot JG，et al. Airway remodelling in COPD：It′s not asthma！ [J]. Respirology，2016，21（8）：1347-1356.

[19]? 李紅，呂志強，梁瑞韻.慢性阻塞性肺疾病合并心血管疾病的研究進展[J].臨床肺科雜志，2017，22（4）：729-734.

[20]? 賀建峰，姚旭升，楊靜，等.基于關(guān)聯(lián)規(guī)則算法的慢性阻塞性肺疾病及其協(xié)同發(fā)病分析[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，2018，37（6）：618-623，630.

[21]? Hou C，Kong J，Liang Y，et al. HMGB1 contributes to allergen-induced airway remodeling in a murine model of chronic asthma by modulating airway inflammation and activating lung fibroblasts [J]. Cell Mol Immunol，2015， 12（4）：409-423.

[22]? Bellussi LM，Iosif C，Sarafoleanu C，et al. Are HMGB1 protein expression and secretion markers of upper airways inflammatory diseases？ [J]. J Biol Regul Homeost Agents，2013，27（3）：791-804.

[23]? Huang KF，Huang WT，Lin KC，et al. Interleukin-1 receptor antagonist inhibits the release of glutamate，hydroxyl radicals，and prostaglandin E in the hypothalamus during pyrogen-induced fever in rabbits [J]. Eur J Pharmacol，2010，629（1）：125-131.

[24]? 王志華，謝俊剛.慢性阻塞性肺疾病的表觀遺傳學(xué)機制研究進展[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2017，40（6）：472-474.

[25]? 肖文香，程知音.噻托溴銨對慢性阻塞性肺疾病急性發(fā)作期患者血清炎性因子和血氣分析指標(biāo)的影響[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2018，18（9）：1235-1237.

[26]? 李進勇，曾瑋.沙美特羅氟替卡松對急性加重期COPD患者骨代謝以及氣道重塑的影響分析[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，16（14）：1406-1410.

（收稿日期：2019-01-21? 本文編輯：王? ?蕾）