HPLC法測(cè)定復(fù)方感冒靈流膏中7種成分的含量

李柯 陳丹 李軍 侯茜 戚建中 李若存

[摘要] 目的 建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方感冒靈流膏中7種成分含量的高效液相色譜法。 方法 采用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.4%磷酸水溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，柱溫為30℃。 結(jié)果 新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷質(zhì)量濃度分別在5.681～113.62 μg/mL（r = 0.9996）、6.42～128.4 μg/mL（r = 0.9995）、6.806～136.12 μg/mL（r = 0.9996）、3.924～78.48 μg/mL（r = 0.9996）、4.863～97.26 μg/mL（r = 0.9994）、2.273～45.46 μg/mL（r = 0.9991）、43.08～861.6 μg/mL（r = 0.9993）范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;平均加樣回收率（n = 6）分別為97.79%、98.24%、96.92%、97.84%、99.23%、99.00%、100.04%。 結(jié)論 所建立的高效液相色譜法能為復(fù)方感冒靈流膏的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方感冒靈流膏;高效液相色譜法;新綠原酸;綠原酸;隱綠原酸;異綠原酸C;異綠原酸B;異綠原酸A;蒙花苷;質(zhì)量控制

[中圖分類號(hào)] R286.0 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）10（a）-0035-05

Quantitative determination of seven components of Fufang Ganmaoling Fluid Extract by HPLC

LI Ke1 ? CHEN Dan2 ? LI Jun3 ? HOU Xi1 ? QI Jianzhong3 ? LI Ruocun1

1.Hu′nan Academy of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha ? 410013， China; 2.Xiangtan Medicine & Health Vocational College， Hu′nan Province， Xiangtan ? 411104， China; 3.Huarun Sanjiu （Chenzhou） Pharmaceutical Co.， Ltd.， Hu′nan Province， Chenzhou ? 423000， China

[Abstract] Objective To establish simultaneous determination of 7 components in Fufang Ganmaoling Fluid Extract method by high performance liquid chromatography. Methods Kromasil C18 column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） column was used as the column， acetonitrile- 0.4% phosphoric acid solution was used as the mobile phase of the gradient elute， with the detection wavelength of 327 nm and the flow rate of 1.0 mL/min. The colomn temperature maintained at 30℃. Results The neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， 4，5-dicaffeoylquinic acid， 3，4-dicaffeoylquinic acid， 3，5-dicaffeoylquinic acid， in the range of 5.681-113.62 μg/mL （r = 0.9996）， 6.42-128.4 μg/mL （r = 0.9995）， 6.806-136.12 μg/mL （r = 0.9996）， 3.924-78.48 μg/mL （r = 0.9996）， 4.863-97.26 μg/mL （r = 0.9994）， 2.273-45.46 μg/mL （r = 0.9991）， 43.08-861.6 μg/mL （r = 0.9993） showed good linear relationship with the peak area. The average recovery rates （n = 6） of the seven components were 97.79%， 98.24%， 96.92%， 97.84%， 99.23%， 99.00% and 100.04% respectively. Conclusion The method could be used for the comprehensive quality control of Fufang Ganmaoling Fluid Extract.

[Key words] Fufang Ganmaoling Fluid Extract; High performance liquid chromatography; Neochlorogenic acid; Chlorogenic acid; Cryptochlorogenic acid; 4，5-dicaffeoylquinic acid; 3，4-dicaffeoylquinic acid; 3，5-dicaffeoylquinic acid; Buddleoside; Quality control

復(fù)方感冒靈顆粒由山銀花、五指柑等6味中藥和對(duì)乙酰氨基酚等3種西藥制成，功能為辛涼解表，清熱解毒，臨床用于風(fēng)熱感冒及溫病之發(fā)熱，微惡風(fēng)寒，頭身痛，口干而渴，鼻塞涕濁，咽喉紅腫疼痛，咳嗽，痰黃粘稠。本品療效確切，市場(chǎng)需求量大，國(guó)內(nèi)有多家企業(yè)生產(chǎn)?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)均未對(duì)中藥流膏與成品建立定性定量指標(biāo)，不能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，成為制約復(fù)方感冒靈顆粒產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題[1]。流膏為連接中藥飲片與成品的橋梁，其質(zhì)量與成品質(zhì)量的均一性，療效的一致性密切相關(guān)。目前，關(guān)于復(fù)方感冒靈流膏質(zhì)量控制方法的研究未見報(bào)道，在前期建立流膏（中間體）指紋圖譜的基礎(chǔ)上[2-3]，本試驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方感冒靈流膏中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C[4-7]、蒙花苷[8-9]7種有效成分含量的方法，為復(fù)方感冒靈顆粒流膏（中間體）及成品的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（2695型，美國(guó)Waters;LC-20A型，日本島津）。紫外檢測(cè)器（SPD-20A型，日本島津）。電子分析天平（XS205，瑞士Mettler Toledo，十萬(wàn)分之一）。超聲波清洗器（KQ800-KDE，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

復(fù)方感冒靈流膏由華潤(rùn)三九（郴州）制藥有限公司提供，共取10批，批號(hào)分別為Z1701104、Z1701105、Z1701106、Z1701107、Z1701108、Z1701109、Z1701110、Z1701111、Z1701112、Z1701113，分別編號(hào)為S1～S10。蒙花苷對(duì)照品（批號(hào)：111528-201710，含量以96.6%計(jì)）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201716，含量以99.3%計(jì)）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-18031001，含量以99.67%計(jì)）、隱綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-18032403，含量以99.07%計(jì)）、異綠原酸A對(duì)照品（批號(hào)：MUST-18032601，含量以98.82%計(jì)）、異綠原酸B對(duì)照品（批號(hào)：MUST-18031602，含量以99.05%計(jì)）、異綠原酸C對(duì)照品（批號(hào)：MUST-18031603，含量以99.84%計(jì)）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈為色譜純（購(gòu)自Tedia公司），甲醇、乙醇均為分析純（長(zhǎng)沙市匯虹化玻儀器設(shè)備有限公司），水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方感冒靈流膏的制備

稱取山銀花104 g、五指柑415 g、野菊花310 g、三叉苦520 g、南板藍(lán)根310 g、崗梅835 g，加水煎煮2次，煎液合并濃縮至適量，加乙醇沉淀，濾過，濾液濃縮成流膏。

2.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%的磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～20 min A：3%→15%，B：97%→85%;20～45 min A：15%→24%，B：85%→76%;45～55 min A：24%→35%，B：76%→65%;55～60 min A：35%→3%，B：65%→97%;60～65 min A：3%，B：97%。檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 ?精密稱取7種對(duì)照品各適量，加50%甲醇制成濃度分別為綠原酸0.6420 mg/mL、新綠原酸0.5681 mg/mL、隱綠原酸0.6806 mg/mL、異綠原酸A 0.2273 mg/mL、異綠原酸B 0.4863 mg/mL、異綠原酸C 0.3924 mg/mL、蒙花苷4.3080 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。再精密量取上述混合對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，得到濃度分別為綠原酸64.20 μg/mL、新綠原酸56.81 μg/mL、隱綠原酸68.06 μg/mL、異綠原酸A 22.73 μg/mL、異綠原酸B 48.63 μg/mL、異綠原酸C 39.24 μg/mL、蒙花苷430.80 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 ?稱取復(fù)方感冒靈流膏1.0 g，精密稱定，置150 mL錐形瓶中，加50%甲醇約50 mL，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，冷卻，重新稱重，用50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，即得。

2.3.3 空白對(duì)照溶液 ?按復(fù)方感冒靈流膏處方和制備工藝制備缺野菊花的空白樣品及缺山銀花、野菊花、五指柑及崗梅的空白樣品，并按“2.3.2”項(xiàng)下方法分別制成缺野菊花和缺山銀花、野菊花、五指柑及崗梅的空白對(duì)照溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1專屬性試驗(yàn) ?分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（S1）與空白溶液各10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定，即得。見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察 ?精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，各置10 mL容量瓶中，分別加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得一系列濃度的對(duì)照品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸方程計(jì)算，結(jié)果見表1。

2.4.3 精密度試驗(yàn) ?取混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷峰面積計(jì)，RSD分別為1.52%、1.28%、1.67%、1.36%、1.12%、1.80%、2.66%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) ?取供試品溶液（S1），分別于放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定，以新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷峰面積計(jì)，RSD分別為1.25%、1.32%、1.64%、1.77%、1.51%、1.68%、1.94%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) ?取同一批樣品（S1）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定記錄峰面積。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷含量平均值分別為2.75、3.18、3.36、1.84、2.15、0.82、12.64 mg/g，RSD分別為1.99%、1.67%、2.28%、2.09%、2.64%、2.41%、2.50%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) ?取同一批樣品（S1）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，采用高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷含量平均值分別為2.66、3.32、3.50、1.81、2.31、0.89、12.92 mg/g，RSD分別為1.82%、1.35%、2.06%、1.99%、2.72%、2.17%、2.32%，表明本方法中間精密度良好。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) ?精密稱取同一批已知含量樣品（S1）6份，分別加入與供試液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷約成1∶1對(duì)照品量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率。見表2。

2.5 樣品含量測(cè)定

取10批復(fù)方感冒靈流膏，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、蒙花苷含量。見表3。

3 討論

前期通過HPLC-Q-TOF-MS/MS對(duì)復(fù)方感冒靈流膏指紋圖譜中的主要色譜峰進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，明確了流膏中的主要成分為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C及蒙花苷[3，10-19]，因此，本試驗(yàn)選擇上述7種成分作為流膏測(cè)定的指標(biāo)性成分。鑒于綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C為方中山銀花、崗梅、五指柑、野菊花的共有成分，蒙花苷為野菊花的特有成分，因此在設(shè)計(jì)陰性對(duì)照時(shí)，制備了缺山銀花、崗梅、五指柑、野菊花四味藥材的陰性樣品及缺野菊花的陰性樣品。

本試驗(yàn)用二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，各有機(jī)酸的最大吸收波長(zhǎng)為（327±2）nm[20]，蒙花苷的最大吸收波長(zhǎng)為334 nm[20]，分別采用327 nm與334 nm對(duì)7種成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果兩波長(zhǎng)下測(cè)定的含量相差無異，但327 nm有機(jī)酸類的峰面積值均較大，因此選擇327 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

研究表明，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、護(hù)肝作用[10-21]，蒙花苷有抗菌、抗氧化、護(hù)肝及抗血管炎癥損傷的作用[22-23]，這些成分均源自于本方中的山銀花、崗梅、五指柑、野菊花。本試驗(yàn)首次建立了同時(shí)測(cè)定復(fù)方感冒靈顆粒流膏中蒙花苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的HPLC分析方法，該法靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，操作簡(jiǎn)單易行，為該產(chǎn)品的中間體健立了一個(gè)全面有效的質(zhì)量控制方法。

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（收稿日期：2019-04-19 ?本文編輯：劉永巧）