EZH2在大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)后缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制

鐘云萍 張健健 王磊 劉修恒

武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 ? 430060

[摘要] 目的 探討Zeste同源物增強(qiáng)子2（EZH2）在大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制。 方法 18只成年健康雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、缺血組和EZH2抑制劑組，每組6只。對(duì)照組：將游離后的睪丸順時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°后立即復(fù)位、固定;缺血組和EZH2抑制劑組：將游離后的睪丸順時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°，維持2 h后將扭轉(zhuǎn)的睪丸復(fù)位、固定。EZH2抑制劑組在扭轉(zhuǎn)造模前腹腔注射EZH2抑制劑UNC1999 [50 mg/（kg·d）]，連續(xù)3 d。對(duì)照組和缺血再灌注組腹腔注射同體積磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。各組大鼠在扭轉(zhuǎn)再?gòu)?fù)位4 h后處死，獲取缺血后的睪丸組織，檢測(cè)三組睪丸組織中的超氧化物歧化酶活性（SOD）和丙二醛（MDA）含量;蘇木精-伊紅染色和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)法觀察組織病理學(xué)改變和生精細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）;免疫蛋白印跡檢測(cè)各組睪丸組織EZH2、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶-1（HO-1）的表達(dá)水平。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，缺血組和EZH2抑制劑組在睪丸復(fù)位后SOD活性下降，Nrf2、HO-1表達(dá)降低，MDA、AI、EZH2水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。與缺血組比較，EZH2抑制劑組的SOD活性升高，Nrf2、HO-1的表達(dá)升高，MDA、AI、EZH2水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 EZH2在睪丸缺血再灌注過程中發(fā)揮重要作用，EZH2抑制劑可保護(hù)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能是通過增強(qiáng)Nrf2/HO-1通路、抑制細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] Zeste同源物增強(qiáng)子2;睪丸;扭轉(zhuǎn);缺血

[中圖分類號(hào)] R726.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）10（a）-0021-04

Effect of EZH2 on testicular ischemia-reperfusion injury in rats

ZHONG Yunping ? ZHANG Jianjian ? WANG Lei ? LIU Xiuheng

Department of Urology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province，Wuhan ? 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of EZH2 on testicular ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Eighteen adult healthy male SD rats were randomly divided into control group， ischemia group and EZH2 inhibition group， 6 rats in each group. The free testicles were immediately repositioned and fixed after clockwise torsion of 720° in control group. The free testicles were rotated torsion of 720° and maintained for 2 h in ischemia group and EZH2 inhibition group. Before clockwising torsion， EZH2 inhibitor group was intraperitoneally injected with E2H2 inhibitor UNC1999 [50 mg/（kg·d）] for 3 days， while the control group and ischemia group were intraperitoneally injected with the phosphate buffer saline （PBS） of same volume. Rats in each group were sacrificed after 4 h of torsion and reposition， and the ischemic testicular tissues were obtained. The levels of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） were measured. Histopathoiogical changes and germ cell apoptosis indices （AI） were observed using hematoxylin-eosin staining and in situ terminal transferase labeling technique. The expressions of EZH2， NF-E2-related factor 2 （Nrf2） and heme oxygenase-1 （HO-1） were detected using Western blot. Results Compared with control group， the activity of SOD and the expression of Nrf2 and HO-1 were decreased after reduction， the expressions of MD， AI and EZH2 were increased in ischemic group and EZH2 inhibitor group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Compared with ischemic group， the activity of SOD and the expression of Nrf2 and HO-1 were increased after reduction， the expressions of MDA， AI and EZH2 were decreased in EZH2 inhibitor group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion EZH2 plays an important role in testicular ischemia-reperfusion injury. EZH2 inhibitor exerts a beneficial effect of testicles torsion repositioned after ischemia-reperfusion injury. This effect may be achieved through enhancing Nrf2/HO-1 expression and inhibiting apoptosis.

[Key words] Zeste homologous enhancer 2; Testicle; Torsion; Ischemia

Zeste同源物增強(qiáng)子2（EZH2）是果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源基因[1]，定位于人類染色體7q35-7q36區(qū)間上，是多梳家族（polycomb group，PcG）的重要成員之一，具有促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及控制腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等重要作用[2]。睪丸扭轉(zhuǎn)是青少年泌尿外科的常見急癥之一[3-4]。如果扭轉(zhuǎn)的睪丸在6 h內(nèi)不能復(fù)位恢復(fù)血供，則扭轉(zhuǎn)睪丸的生精細(xì)胞會(huì)發(fā)生不可逆性損傷[5-6]。即使手術(shù)復(fù)位及時(shí)，患者術(shù)后仍有可能出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸的生精功能下降，甚至出現(xiàn)睪丸萎縮[4，7]，其機(jī)制與睪丸扭轉(zhuǎn)再?gòu)?fù)位后的缺血再灌注過程緊密相關(guān)[8]。近年來關(guān)于EZH2在器官缺血再灌注損傷中的作用研究較多，但在睪丸缺血再灌注損傷中的作用，目前尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本研究旨在探討EZH2在睪丸缺血再灌注中的作用及機(jī)制，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性SD大鼠18只，體重250～300 g，購(gòu)自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：420098000 01176）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。EZH2抑制劑UNC1999購(gòu)于MedChemExpress公司。Nrf2、HO-1、EZH2抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，BCA蛋白濃度試劑盒（P00105，0405 17170901）購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所?？偝跗缁福⊿OD）測(cè)定試劑盒（20180109），丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（20180620），TUNEL凋亡原位檢測(cè)試劑盒（TE331C9），購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 模型的建立與分組

18只成年健康雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、缺血組和EZH2抑制劑組，每組6只。各組大鼠在麻醉后取下腹部直切口，仔細(xì)游離左側(cè)睪丸后，切斷睪丸引帶并分離至附睪頭。對(duì)照組：將游離后的睪丸順時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°后立即復(fù)位、固定;缺血組和EZH2抑制劑組：將游離后的睪丸順時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°，維持2 h后將扭轉(zhuǎn)的睪丸復(fù)位、固定。EZH2抑制劑組在扭轉(zhuǎn)造模前腹腔注射EZH2抑制劑UNC1999[50 mg/（kg·d）]，連續(xù)3 d。對(duì)照組和缺血組腹腔注射同體積的磷酸緩沖鹽液（PBS）。

1.3 樣本采集和處理

1.3.1 樣本采集 ?各組大鼠在扭轉(zhuǎn)再?gòu)?fù)位4 h后處死，獲取缺血后的睪丸組織，一部分迅速置于液氮中保存;另一部分迅速置于固定液中固定24 h，石蠟包埋后切片，檢測(cè)睪丸的病理學(xué)變化和生精細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。

1.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量檢測(cè) ?獲取的各組睪丸組織標(biāo)本按照南京建成檢測(cè)試劑盒的操作步驟檢測(cè)。

1.3.3 AI檢測(cè) ?獲取的各組睪丸組織標(biāo)本按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察。細(xì)胞核呈棕黃色者為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，AI為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量的比值。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查 ?獲取的各組睪丸組織標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后，依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟等操作，待蘇木精-伊紅染色（HE染色）完成后，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察其病理變化。

1.3.5 Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果 ?獲取的各組睪丸組織標(biāo)本后使用BCA法計(jì)算各組蛋白濃度。取40 μg不同分組的蛋白樣本上樣，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，加入EZH2、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶-1（HO-1），稀釋比例為1∶1000， 4℃下?lián)u床孵育過夜，與相應(yīng)二抗按照1∶2000的比例稀釋，孵育1 h，洗膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色、照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組睪丸組織SOD活性、MDA含量及AI測(cè)定結(jié)果比較

缺血組和EZH2抑制劑組的SOD活性均顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;缺血組和EZH2抑制劑組的MDA含量顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;EZH2抑制劑組SOD活性明顯高于缺血組，MDA含量明顯低于缺血組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。缺血組的AI顯著高于對(duì)照組和EZH2抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;EZH2抑制劑組的AI顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1、表1。

注：與對(duì)照組比較，*P < 0.05;與缺血組比較，#P < 0.05。EZH2：Zeste同源物增強(qiáng)子2;SOD：超氧化物歧化酶;MDA：丙二醛;AI：凋亡指數(shù)

2.2 三組睪丸組織病理學(xué)檢查結(jié)果比較

缺血組睪丸曲細(xì)精管直徑變小，生精上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量減少，生精阻滯。EZH2抑制劑組組織病理學(xué)檢查結(jié)果較缺血組有所緩解。見圖2。

2.3 三組睪丸組織Western blot檢測(cè)結(jié)果比較

缺血組Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組和EZH2抑制劑組，EZH2抑制劑組Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。缺血組EZH2蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組和EZH2抑制劑組，EZH2抑制劑組EZH2蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見圖3、表2。

A：對(duì)照組;B：缺血組;C：EZH2抑制劑組。EZH2：Zeste同源物增強(qiáng)子2;Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2;H0-1：血紅素氧合酶-1

注：與對(duì)照組比較，*P < 0.05;與缺血組比較，#P < 0.05。EZH2：Zeste同源物增強(qiáng)子2;Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2;H0-1：血紅素氧合酶-1

3 討論

睪丸扭轉(zhuǎn)再?gòu)?fù)位造成的缺血損傷是不可逆轉(zhuǎn)的，最終會(huì)導(dǎo)致不育[9]。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位會(huì)發(fā)生典型的睪丸缺血再灌注損傷，導(dǎo)致扭轉(zhuǎn)睪丸的生精細(xì)胞發(fā)生代謝性損傷，如氧自由基損傷、炎癥因子釋放、基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)異常等病理生理學(xué)改變[10]。雖然正常睪丸細(xì)胞可產(chǎn)生氧自由基，但是在缺血再灌注過程中氧自由基的過量生成會(huì)對(duì)睪丸細(xì)胞的功能造成損害[11]。機(jī)體存在的抗氧化系統(tǒng)可以清除一定的氧自由基及其代謝產(chǎn)物，而當(dāng)缺血再灌注過程中氧自由基大量生成，體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)之間的平衡會(huì)被破壞[12-13]。因此，清除睪丸扭轉(zhuǎn)再?gòu)?fù)位中的氧自由基對(duì)減輕缺血造成的氧化損傷至關(guān)重要[14]。

EZH2是果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源基因，定位于人類染色體7q35-7q36區(qū)間上，是PcG基因家族的重要成員之一。EZH2可通過甲基化修飾核小體組蛋白H3的第27位賴氨酸，沉默相關(guān)基因表達(dá)，影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。EZH2在器官缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。Miti等[15]發(fā)現(xiàn)EZH2在肢體缺血再灌注損傷中表達(dá)升高，通過組蛋白H3第27位賴氨酸上三甲基化（H3K27me3）修飾可抑制血管生成基因內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)，從而加重缺血再灌注損傷。Gong等[16]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，EZH2介導(dǎo)的H3K27me3修飾可抑制FoxO3A蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸扭轉(zhuǎn)再?gòu)?fù)位后缺血再灌注損傷過程中EZH2表達(dá)升高，說明EZH2在睪丸缺血再灌注過程中發(fā)揮重要作用。抑制EZH2的表達(dá)，可明顯減輕睪丸缺血再灌注損傷，升高因缺血導(dǎo)致的SOD活性，降低MDA含量;同時(shí)抑制EZH2表達(dá)可改善缺血后的睪丸曲細(xì)精管直徑變小、生精上皮細(xì)胞排列紊亂等組織病理學(xué)改變，說明EZH2促進(jìn)睪丸缺血再灌注損傷與增強(qiáng)氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1相結(jié)合形成復(fù)合體，使Nrf2經(jīng)泛素蛋白酶途徑降解[17-18]。當(dāng)發(fā)生睪丸缺血再灌注損傷時(shí)，氧化應(yīng)激可引起Nrf2與其接頭蛋白Keap1復(fù)合體解離，Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，啟動(dòng)抗氧化基因的表達(dá)，HO-1是受Nrf2調(diào)控的重要酶類，形成Nrf2/HO-1通路[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生睪丸缺血再灌注損傷時(shí)，Nrf2/HO-1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞AI升高，SOD水平下降、MDA含量上升。而當(dāng)抑制EZH2表達(dá)后，Nrf2/HO-1表達(dá)水平上升，細(xì)胞凋亡明顯減輕，SOD水平上升、MDA含量下降。說明睪丸缺血再灌注損傷中，通過增強(qiáng)Nrf2/HO-1表達(dá)水平，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕睪丸生精細(xì)胞凋亡，抑制EZH2的表達(dá)。

綜上所述，EZH2抑制劑對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)再?gòu)?fù)位后的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過增強(qiáng)Nrf2/HO-1通路的表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)，提示EZH2抑制劑可作為治療睪丸缺血再灌注損傷的藥物。

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（收稿日期：2019-04-23 ?本文編輯：任 ? 念）