阿托伐他汀鈣片對腎病綜合征模型大鼠腎損傷的改善作用及機制研究

沈先敏 程瑾 劉恒

中圖分類號 R965；R692 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）03-0314-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.07

摘 要 目的：研究阿托伐他汀鈣片對腎病綜合征模型大鼠腎損傷的改善作用，并探討其可能的作用機制。方法：取Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組和阿托伐他汀鈣片組，每組10只，模型組和阿托伐他汀鈣片組大鼠尾靜脈注射劑量為6 mg/kg的阿霉素，連續(xù)給藥21 d復(fù)制腎病綜合征模型，從第22天起阿托伐他汀鈣片組大鼠灌胃劑量為8 mg/kg的藥物，同時正常組和模型組大鼠灌胃等量蒸餾水，每天給藥1次，每周連續(xù)給藥6 d，連續(xù)給藥10周。末次給藥第2天，檢測各組大鼠血漿白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、膽固醇（CH）、尿蛋白排泄率（UAE）水平；采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）法和Western blot法檢測肝組織中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB） mRNA及其蛋白的表達水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠ALB、TP水平以及AMPK、SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P<0.01或P<0.001），CH、UAE水平以及NF-κB mRNA和蛋白表達水平均明顯增加（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。與模型組比較，阿托伐他汀鈣片組大鼠ALB、TP水平以及AMPK、SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均明顯增加（P<0.05或P<0.01或P<0.001），CH、UAE水平以及NF-κB mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。結(jié)論：阿托伐他汀鈣片具有明顯改善腎病綜合征模型大鼠腎損傷的作用，其作用機制可能與上調(diào)AMPK、SIRT1表達和下調(diào)NF-κB表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 阿托伐他汀鈣片；腎病綜合征；大鼠；作用機制

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Atorvastatin calcium tablets on renal injury in nephrotic syndrome model rats， and to explore its possible mechanism. METHODS： Wistar rats were randomly divided into normal group， model group and Atorvastatin calcium tablets group， with 10 rats in each group. Model group and Atorvastatin calcium tablets group rats were given adriamycin 6 mg/kg intravenously for consecutive 21 d to induce nephrotic syndrome model. Since 22th day， Atorvastatin calcium tablets group was given drug 8 mg/kg intragastrically while normal group and model group rats were given equal amount of distilled water intragastrically， once a day， consecutive 6 days every week， for consecutive 10 weeks. At the second day after last medication， the plasma levels of albumin （ALB）， total protein （TP）， cholesterol （CH）， urine albumin excretion rate （UAE） were determined in each group. RP-PCR and Western blot assay were used to detect mRNA and protein expression of AMP-activated protein kinase （AMPK）， silent information regulator 1 （SIRT1） and nuclear factor κB （NF-κB） in liver tissue. RESULTS： Compared with normal group， the levels of ALB and TP， mRNA and protein expression of AMPK and SIRT1 were decreased significantly in model group （P<0.01 or P<0.001）， while the levels of CH and UAE， mRNA and protein expression of NF-κB were increased significantly （P<0.05 or P<0.01 or P<0.001）. Compared with model group， the levels of ALB and TP， mRNA and protein expression of AMPK and SIRT1 were increased significantly in Atorvastatin calcium tablets group （P<0.05 or P<0.01 or P<0.001）， while the levels of CH and UAE， mRNA and protein expression of NF-κB were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01 or P<0.001）. CONCLUSIONS： Atorvastatin calcium tablets has significant improvement effect on the renal injury of nephritic syndrome model rats， the mechanism of which may be associated with up-regulating the expression of AMPK and SIRT1 and down-regulating the expression of NF-κB.

KEYWORDS Atorvastatin calcium tablets； Nephrotic syndrome； Rats； Mechanism

腎病綜合征分為原發(fā)性腎病綜合征和繼發(fā)性腎病綜合征，臨床上對腎病綜合征的診斷方法主要是通過檢測尿蛋白、血漿蛋白的含量，以及是否發(fā)生水腫和高血脂來判定是否為腎病綜合征。腎病綜合征通常伴隨感染、血栓及栓塞性并發(fā)癥、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂，嚴重時可導(dǎo)致急性腎衰竭[1]。有相關(guān)文獻已經(jīng)證實，腎病綜合征的發(fā)生與炎癥因子密切相關(guān)，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）這條信號通路對炎癥因子的調(diào)控具有重要作用[2-3]。阿托伐他汀鈣片說明書提示，其主要用于高膽固醇血癥和混合型高脂血癥的治療以及冠心病和腦中風(fēng)的防治。有研究表明，阿托伐他汀鈣片對腎病綜合征也具有良好的治療作用，其主要是通過調(diào)節(jié)腎病綜合征的脂質(zhì)代謝異常以及減輕氧化應(yīng)激來實現(xiàn)的[4]，但是其具體的作用機制尚不明確。本研究利用阿霉素復(fù)制腎病綜合征大鼠模型，研究阿托伐他汀鈣片對腎病綜合征模型大鼠的改善作用以及與AMPK/SIRT1/ NF-κB信號通路相關(guān)的機制研究，以期為臨床應(yīng)用阿托伐他汀鈣片治療腎病綜合征提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2700型聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；1-16K型離心機（德國西格瑪公司）；DZY-212型電泳儀、DZY-ZZY型電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）；7600-020型全自動生化儀（日本日立公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸多柔比星（多柔比星又名阿霉素，日本明治制藥株式會社，批號：20180105，規(guī)格：10 mg）；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批號：128972，規(guī)格：20 mg）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑Premix Taq、實時定量（RT）-PCR試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；羊抗兔二抗和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔源AMPK多克隆抗體（英國Abcam公司）；兔源SIRT1多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；兔源NF-κB多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；所有引物均采用Primer 6.0軟件設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 動物

30只Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量約200 g，6周齡，購自中國藥科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)合格證號為SCKX（蘇）2018-0010，本實驗所有操作均遵守中國藥科大學(xué)實驗動物倫理委員會要求。

2 方法

2.1 分組與給藥

將大鼠隨機分為正常組、模型組和阿托伐他汀鈣片組，每組10只，模型組和阿托伐他汀鈣片組大鼠單次尾靜脈注射劑量為6 mg/kg的阿霉素[5]，每天給藥1次，連續(xù)給藥21 d復(fù)制腎病綜合征模型，從第22天起阿托伐他汀鈣片組大鼠灌胃劑量為8 mg/kg的阿托伐他汀鈣片[6]，同時正常組和模型組大鼠灌胃等量蒸餾水，每天給藥1次，每周連續(xù)給藥6 d，連續(xù)給藥10周。

2.2 血漿生化指標以及尿蛋白排泄率的測定

末次給藥第2天，大鼠禁食12 h后稱體質(zhì)量，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，頸主動脈采血，裝于高壓蒸汽滅菌后的4 mL的離心管中，采用全自動生化儀測定其中血漿白蛋白（ALB）、總蛋白（TB）、膽固醇（CH）含量。用代謝籠收集大鼠末次給藥12 h后的尿液，連續(xù)收集12 h，采用考馬斯亮藍法檢測其中尿蛋白含量，計算尿蛋白排泄率（UAE）。

2.3 RT-PCR法檢測腎組織中AMPK、SIRT1、NF-κB mRNA表達

采用Trizol法提取腎組織中總RNA，2.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再進行PCR擴增。擴增基因包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、AMPK、SIRT1、NF-κB。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離，并應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比表示目的基因的相對表達量。引物序列與產(chǎn)物長度見表1。

2.4 Western blot法檢測腎組織中AMPK、SIRT1、NF-κB 蛋白表達

用RIPA裂解液-苯甲基磺酰氟（PMSF）（1 ∶ 100）混合裂解液提取大鼠腎組織的蛋白質(zhì)后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，轉(zhuǎn)膜，分別以兔源β-actin單克隆抗體（1 ∶ 500）、兔源AMPK多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、兔源SIRT1多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、兔源NF-κB多克隆抗體（1 ∶ 800）為一抗孵育過夜，再以羊抗兔二抗（1 ∶ 10 000），搖床孵育1.5 h，TBST緩沖液漂洗15 min后，采用電化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色成像，使用Image J軟件計算目標蛋白與內(nèi)參β-actin的比值評價目標蛋白的表達水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血漿生化指標和UAE

與正常組比較，模型組大鼠血漿中ALB、TP含量明顯降低（P<0.001），CH含量和UAE明顯升高（P<0.001）。與模型組比較，阿托伐他汀鈣片組大鼠血漿中ALB、TP含量明顯升高（P<0.01或P<0.001），CH含量和UAE明顯降低（P<0.01或P<0.001）。各組大鼠血漿生化指標和UAE的測定結(jié)果見表2。

3.2 腎組織中AMPK、SIRT1、NF-κB mRNA表達

與正常組比較，模型組大鼠腎組織中，AMPK和SIRT1 mRNA相對表達量明顯降低（P<0.01），NF-κB mRNA相對表達量明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，阿托伐他汀鈣片組大鼠腎組織中，AMPK和SIRT1 mRNA相對表達量明顯增加（P<0.05），NF-κB mRNA相對表達量明顯降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織中AMPK、SIRT1、NF-κB mRNA表達的電泳圖見圖1，測定結(jié)果見表3。

3.3 腎組織中AMPK、SIRT1、NF-κB蛋白表達

與正常組比較，模型組大鼠腎組織中，AMPK和SIRT1蛋白表達水平明顯降低（P<0.01），NF-κB 蛋白表達水平明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀鈣片組大鼠腎組織中，AMPK和SIRT1蛋白表達水平明顯增加（P<0.05），NF-κB蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織中AMPK、SIRT1、NF-κB mRNA蛋白的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表4。

4 討論

AMPK信號通路是一種抗炎信號途徑，AMPK相關(guān)的信號通路在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[2，7-8]。研究表明，AMPK 通過激活SIRT1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）共激活因子1α（PGC-1α）等途徑，抑制 NF-κB、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等多種炎癥蛋白的活性，從而抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展[9-11]。NF-κB是哺乳動物體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，與機體的炎癥反應(yīng)相關(guān)，NF-κB 的過度表達或激活與腎病綜合征密切相關(guān)[12-13]。阿托伐他汀鈣片目前的主要用途是抗動脈粥樣硬化、降低血壓、抗心律失常等[14-16]，另外基礎(chǔ)研究和臨床研究也已經(jīng)表明，阿托伐他汀鈣片還可有效改善機體的血脂水平[17]，對腎病綜合征患者的血脂水平有很好的調(diào)節(jié)作用[18]，可改善腎病綜合征的病理狀態(tài)，但是其具體的機制尚不明確。國內(nèi)外有相關(guān)文獻報道阿托伐他汀鈣片作用機制與AMPK介導(dǎo)的炎癥的信號密切相關(guān)[19]?；诖耍狙芯渴褂冒⑼蟹ニ♀}片（8 mg/kg）灌胃治療腎病綜合征模型大鼠，10周后檢測其血漿生化指標和UAE，并通過RT-PCR和Western blot法檢測各組大鼠腎組織中AMPK、SIRT1、NF-κB mRNA及其蛋白的表達。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀鈣片能明顯改善腎病綜合征模型大鼠的血漿生化指標和UAE，并對AMPK、SIRT1、NF-κB mRNA和蛋白的表達具有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，阿托伐他汀鈣片具有明顯改善腎病綜合征模型大鼠腎損傷的作用，其作用機制可能與上調(diào)AMPK、SIRT1表達和下調(diào)NF-κB表達有關(guān)。但由于本研究阿托伐他汀鈣片只設(shè)置了一個劑量組，且動物樣本量較少，后期還需要增加不同劑量和擴大動物樣本量來進一步驗證。

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（收稿日期：2018-06-27 修回日期：2018-11-10）

（編輯：鄒麗娟）