Box—Behnken設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法優(yōu)選雪松松針中蛇床子素的提取工藝

范彬 李琳 石曉峰 沈薇 馬趣環(huán) 劉東彥 王新娣

中圖分類號(hào) R932 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）03-0359-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.16

摘 要 目的：優(yōu)選雪松松針中蛇床子素的提取工藝。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定蛇床子素含量。在單因素考察的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比為考察因素，以蛇床子素含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選雪松松針中蛇床子素的提取工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：確定的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)88%，料液比1 ∶ 20（g/mL），提取2次、每次57 min。在此工藝條件下，提取得到蛇床子素的平均含量為0.675 7 mg/g（RSD=1.78%，n=3），與預(yù)測(cè)值0.680 9 mg/g的相對(duì)誤差為0.59%。結(jié)論：優(yōu)選的最佳提取工藝方法簡(jiǎn)便、可行，可用于雪松松針中蛇床子素的提取。

關(guān)鍵詞 雪松松針；蛇床子素；提取工藝；Box-Behnken設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of osthole from the pine needles of Cedrus deodara. METHODS： HPLC method was adopted to determine the content of osthole. Based on single factor test， ethanol volume fraction， extraction time and material-solvent ratio were selected as influential factors， and the content of osthole was selected as response value. Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the extraction technology of osthole in pine needles of C. deodara. Validation test was conducted. RESULTS： The optimal extraction technology was as follows as ethanol volume fraction of 88%， material-solvent ratio of 1 ∶ 20 （g/mL）， extracting for 2 times， lasting for 57 min each time. Under this technology， average content of osthole was 0.675 7 mg/g （RSD=1.78%， n=3）， and the relative error of which to predicted value 0.680 9 mg/g was 0.59%. CONCLUSIONS： The optimal extraction technology is simple and feasible，and it can be used for the extraction of osthole from the pine needles of C. deodara.

KEYWORDS Pine needles of Cedrus deodara； Osthole； Extraction technology； Box-Behnken design； Response surface methodology

雪松[Cedrus deodara （Roxb.） G.Don.]又名喜馬拉雅雪松、喜馬拉雅杉、香柏，是松科（Pianaceae）雪松屬（Cedrus Trew）植物，其針葉藥用歷史悠久，其中的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、黃酮類、苯丙素類、有機(jī)酸類、三萜類、甾體類、多糖及針葉膠類等，具有抗腫瘤、抗氧化、抗褐變、抗菌等藥理活性[1-2]。本課題組前期對(duì)雪松松針進(jìn)行了諸多研究，如采用高效液相色譜法/紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定雪松不同部位中4個(gè)黃酮類化合物、5種酚酸類成分以及原花青素的含量[3-5]；并且通過(guò)對(duì)雪松松針中丹皮酚、蛇床子素、和厚樸酚、厚樸酚4個(gè)有效成分的含量測(cè)定[6]，發(fā)現(xiàn)其中蛇床子素含量較高。

蛇床子素又稱甲氧基歐芹素，屬于香豆素類化合物，具有較強(qiáng)的藥理活性，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等多種疾病均具有較為明顯的藥理作用[7]，是一個(gè)值得進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用的活性成分。為了從雪松松針中提取純化蛇床子素，本試驗(yàn)擬采用高效液相色譜法測(cè)定蛇床子素含量，在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選雪松松針中蛇床子素的提取工藝，為后續(xù)的研究提供試驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 儀器

1100高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、可變波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)器、1100化學(xué)工作站和標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；AE260萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-4電熱恒溫水浴鍋 （北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

雪松松針于2008年6月采自甘肅省蘭州市，經(jīng)甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院何福江研究員、石長(zhǎng)栓副研究員鑒定為松科雪松屬植物雪松的針葉，將藥材陰干并保存于陰涼庫(kù)，待用；蛇床子素對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-11123014，純度：>98%，供含量測(cè)定用）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取蛇床子素對(duì)照品4.4 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.44 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取雪松松針?lè)勰?0～20目）1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇20 mL，水浴回流提取2 h，過(guò)濾，濾液定容至25 mL棕色量瓶中，即得。

2.2 色譜條件

參考文獻(xiàn)[8-10]設(shè)置。色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（80 ∶ 20，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液與對(duì)照品溶液中蛇床子素色譜峰的保留時(shí)間一致，與相鄰峰間的分離度均>1.5，理論板數(shù)按蛇床子素計(jì)不低于3 000，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20、40、80、120、160、200 μL，分別置于1 mL量瓶中，用95%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的蛇床子素對(duì)照品溶液，然后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、蛇床子素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蛇床子素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=47.477 507 5x+34.644 78（r=0.999 6），表明蛇床子素質(zhì)量濃度在8.8～88.0 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取新鮮配制的質(zhì)量濃度為35.20 μg/mL的蛇床子素對(duì)照品溶液20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素峰面積的RSD=0.82%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取雪松松針?lè)勰?0～20目）1.0 g，共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素的平均含量為0.519 6 mg/g，RSD=2.09%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8、10、24 h后，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素峰面積的RSD=2.09%（n=7），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取雪松松針?lè)勰?0～20目） 0.5 g，共9份，按樣品含量的80%、100%和120%分別加入蛇床子素對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素的平均加樣回收率為101.98%，RSD=1.57%（n=9），表明該方法準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 單因素試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別對(duì)回流提取過(guò)程中影響雪松松針中蛇床子素含量的4個(gè)影響因素（提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取次數(shù)）進(jìn)行逐一考察。

2.5.1 提取時(shí)間對(duì)蛇床子素含量的影響 精密稱取雪松松針?lè)勰?0～20目）1.0 g，共5份，以95%乙醇作為提取溶劑，固定料液比為1 ∶ 20（g/mL），提取次數(shù)為1次，分別于水浴回流提取不同時(shí)間（30、60、90、120、150 min），然后按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算雪松松針提取液中蛇床子素的含量。結(jié)果，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，雪松松針提取液中蛇床子素的含量最高，提取效果最好，故選擇30～90 min的提取時(shí)間進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)。提取時(shí)間對(duì)蛇床子素含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2a。

2.5.2 料液比對(duì)蛇床子素含量的影響 精密稱取雪松松針?lè)勰?0～20目）1.0 g，共5份，以95%乙醇為提取溶劑，提取次數(shù)為1次，設(shè)置不同料液比（1 ∶ 8、1 ∶ 12、1 ∶ 16、 1 ∶ 20、1 ∶ 24，g/mL），于水浴回流提取60 min，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制供試品溶液后，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算雪松松針提取液中蛇床子素含量。結(jié)果，當(dāng)料液比為1 ∶ 20時(shí)，雪松松針提取液中蛇床子素的含量最高，提取效果最好，故選擇料液比為 1 ∶ 16～1 ∶ 24進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)。料液比對(duì)蛇床子素含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2b。

2.5.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蛇床子素含量的影響 精密稱取雪松松針?lè)勰?0～20目）1.0 g，共5份，選擇不同體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%、90%、100%）的乙醇，固定料液比為1 ∶ 20（g/mL），提取次數(shù)為1次，于水浴回流提取60 min，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算雪松松針提取液中蛇床子素含量。結(jié)果，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，雪松松針提取液中蛇床子素含量最高，提取效果最好，故選擇80%～100%的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行Box- Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蛇床子素含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2c。

2.5.4 提取次數(shù)對(duì)蛇床子素含量的影響 精密稱取雪松松針?lè)勰?0～20目）1.0 g，共3份，加入90%乙醇20 mL，選擇不同提取次數(shù)（1、2、3次）于水浴回流提取，每次60 min，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算雪松松針提取液中蛇床子素的含量。結(jié)果，水浴回流提取2次時(shí)，雪松松針提取液中蛇床子素的含量已能達(dá)到提取3次后的90%以上，故最終固定提取次數(shù)為2次進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。提取次數(shù)對(duì)蛇床子素含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2d。

2.6 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.6.1 方案設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間（A）、料液比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）為考察因素，固定提取次數(shù)為2次，以雪松松針提取液中蛇床子素含量（R）為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表2，Box-Behnken 設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert.V 8.0.6軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以蛇床子素含量（R）為響應(yīng)值對(duì)提取時(shí)間（A）、料液比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式方程擬合，得回歸方程為：R=-5.219 22+0.017 496A+0.160 260B+0.087 407C-2.266 67×10-4AB-5.441 67×10-5AC-5.100 00×10-4BC-7.29 528×10-5A2-2.611 41×10-3B2-4.240 75×10-4C2（R2=0.989 7），方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，模型的P<0.000 1，表明回歸方程擬合度良好，具有極顯著的影響；失擬項(xiàng)P=0.471 2>0.05，表明數(shù)據(jù)沒(méi)有異常點(diǎn)。以雪松松針中蛇床子素含量為響應(yīng)值時(shí)，一次項(xiàng)A和C、交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著的影響（P<0.001），一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)BC有高度顯著的影響（P<0.01），交互項(xiàng)AC有顯著的影響（P<0.05），表明所得回歸方程能夠很好地預(yù)測(cè)蛇床子素含量隨各響應(yīng)因子的變化。

2.6.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，通過(guò)響應(yīng)面曲線的變化情況及等高線的稀疏程度可直觀反映各因素對(duì)蛇床子素含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，提取時(shí)間和料液比的交互作用顯著性強(qiáng)；提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用不顯著。蛇床子素含量隨提取時(shí)間及料液比的變化呈現(xiàn)出由低到高再降低的趨勢(shì)，因此在合適的溶劑、提取時(shí)間及料液比下，蛇床子素含量會(huì)有極大值，且應(yīng)位于曲面的頂部。

2.6.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)軟件Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)模型求解方程，得到最優(yōu)提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為87.58%，料液比為1 ∶ 19.67 g/mL，回流提取2次、每次56.68 min，在該條件下蛇床子素含量達(dá)到最大值（0.680 9 mg/g）?？紤]到實(shí)際操作，將蛇床子素的提取工藝調(diào)整如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)為88%，料液比為1 ∶ 20 （g/mL），回流提取2次、每次57 min。在此條件下平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得雪松松針提取液中蛇床子素的平均含量為0.675 7 mg/g（RSD=1.78%，n=3），與模型預(yù)測(cè)值0.680 9 mg/g的相對(duì)誤差為0.59%，表明該工藝條件穩(wěn)定、可靠，同時(shí)也說(shuō)明建立的回歸模型合理。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[8-10]建立了雪松松針提取液中蛇床子素含量測(cè)定的高效液相色譜法，在相同色譜條件下，分別考察了檢測(cè)波長(zhǎng)在249[11]、294[6]、297[12]、310[13]、322 nm[14]處蛇床子素的色譜圖。結(jié)果顯示，蛇床子素在322 nm波長(zhǎng)處的色譜分離度最好，且干擾峰少、響應(yīng)值最高，故最終選用322 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取溶劑的選擇

蛇床子素屬于香豆素類化合物，其提取制備方法有水煎醇沉法、醇提水沉法和氯仿復(fù)提法等。張榮等[11]通過(guò)試驗(yàn)比較后，認(rèn)為醇提水沉法和氯仿復(fù)提法是蛇床子素的良好提取方法，且其中醇提水沉法適合作為大生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)室研究的提取方法。在前期研究中，筆者首先通過(guò)對(duì)不同溶劑（乙醇、甲醇、水）進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)在3種溶劑中以乙醇的提取效果最好，且其體積分?jǐn)?shù)的高低對(duì)蛇床子素含量有很大影響，通過(guò)本試驗(yàn)遴選出88%乙醇作為提取溶劑時(shí)效果最好。

4 結(jié)語(yǔ)

響應(yīng)面法雖試驗(yàn)次數(shù)多于正交試驗(yàn)，但其能建立連續(xù)變量曲面模型，試驗(yàn)方法更直觀、精確。本研究在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化得到了雪松松針中蛇床子素最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)為88%，料液比為1 ∶ 20（g/mL），回流提取2次、每次57 min。經(jīng)驗(yàn)證，在最優(yōu)工藝條件下測(cè)得值與與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為0.59%，表明該提取工藝條件穩(wěn)定、可靠，可用于雪松松針中蛇床子素的提取。

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（收稿日期：2018-11-15 修回日期：2018-12-12）

（編輯：林 靜）