UPLC—Q—TOF—MS法分析防風(fēng)中香豆素類化學(xué)成分

任曉蕾 霍金海 孫國(guó)東 魏文峰 王偉明

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）03-0349-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.14

摘 要 目的：分析防風(fēng)中香豆素類化學(xué)成分，為全面解析防風(fēng)藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。方法：采用超高效液相色譜儀聯(lián)用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）法。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為3 ?L；質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI）在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)，離子噴霧電壓ESI+/ESI-為5 500 V/-4 500 V，去簇電壓為80～-80 V，輔助加熱氣壓力為55.00 psi，霧化氣壓力為-55 psi，氣簾氣壓力為-35.00 psi，去溶劑溫度為550 ℃，碰撞活化掃描能量為15 eV；碰撞電壓為35 psi。通過與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)品圖譜對(duì)照，并結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS提供的化合物準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行成分分析及鑒定。結(jié)果：在ESI+模式下共解析出了135個(gè)化學(xué)成分，在ESI-模式下共解析出了105個(gè)化學(xué)成分。并鑒定出了在ESI+模式下的異歐芹素乙、傘形花內(nèi)酯、東莨菪素、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、Ostenol、秦皮啶、異歐前胡素、5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素、珊瑚菜素、紫花前胡素等11個(gè)香豆素類化學(xué)成分。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、快速，可用于防風(fēng)中香豆素類化學(xué)成分的分析。

關(guān)鍵詞 防風(fēng)；化學(xué)成分；超高效液相色譜儀聯(lián)用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；香豆素

ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze chemical components as coumarin in Saposhnikovia divaricata， and to provide reference for comprehensive analysis of pharmacodynamic material base in S. divaricata. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS method was adopted. Chromatographic condition： the determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid water-0.1% formic acid acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and sample size was 3 ?L. MS condition： ESI， in positive and negative ion mode， ESI+/ESI- 5 500 V/-4 500 V， declustering potential of 80--80 V， auxiliary heating gas pressure of 55.00 psi， atomizing gas pressure of -55 psi， curtain gas pressure of -35.00 psi， desolvent temperature of 550 ℃， collision activation scanning energy of 15 eV， collision voltage of 35 psi. Component analysis was performed by comparing with the related literature data and the standard chromatogram control combined with accurate relative molecular mass of compounds provided by UPLC-Q-TOF-MS. RESULTS： Totally 135 chemical components were analyzed in ESI+ mode， and the 105 chemical components were analyzed in ESI- mode. 11 chemical components as coumarin were identified in ESI+ mode， such as isoimperatorin， umbelliferone， scopolamine， xanthotoxin， psoralen， Ostenol， fraxidin， isoimperatorin， 5-hydroxyl-8-methoxypsoralen， phellopterin， decursin. CONCLUSIONS： The method is accurate and rapid， and can be used for the analysis of chemical components as coumarin in S. divaricata.

KEYWORDS Saposhnikovia divaricata； Chemical components； UPLC-Q-TOF-MS； Coumarin

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)[Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.]未抽花莖植株的干燥根[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[2]，現(xiàn)主產(chǎn)于黑龍江、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、河北等省區(qū)，其中以黑龍江杜爾伯特（泰康）為中心的草原地區(qū)所產(chǎn)的“小蒿子防風(fēng)”品質(zhì)最為優(yōu)良[3]。現(xiàn)代研究表明，防風(fēng)藥材主要含有色原酮、揮發(fā)油、香豆素、多糖及有機(jī)酸等多種化學(xué)成分，具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗凝血及抗腫瘤等活性[4-7]。目前，針對(duì)防風(fēng)的化學(xué)成分研究多見于早年的植化分離[8-10]，質(zhì)量評(píng)定多見于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）防風(fēng)項(xiàng)下2種色原酮成分的含量測(cè)定[1，11-14]，不但檢測(cè)手段單一，且所建立方法不能全面反映防風(fēng)藥材的成分。隨著對(duì)其藥理作用的深入開展，防風(fēng)化學(xué)成分的快速全面鑒定成為亟待解決的問題。本課題組前期已采用超高效液相色譜儀聯(lián)用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）法對(duì)防風(fēng)中最主要的化學(xué)成分——色原酮類成分進(jìn)行了詳細(xì)解析[6]。香豆素類成分為其另一生物活性主要相關(guān)聯(lián)的有效成分，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等藥理作用[7]，故本研究繼續(xù)采用UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)防風(fēng)藥材中次主要成分——香豆素類成分進(jìn)行鑒定，以便進(jìn)一步闡明防風(fēng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.4.4 花椒毒素 峰4的tR為5.4 min，ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z=217[M+H]+，脫去一分子甲基形成特征碎片m/z=202[M+H-CH3]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=174[M+H-CO-CH3]+；準(zhǔn)分子離子峰分別脫去一分子、兩分子CO形成特征碎片m/z=189[M+H-CO]+、m/z=161[M+H-2CO]+，再脫去一分子甲基形成特征碎片m/z=146[M+H-2CO-CH3]+。根據(jù)元素組成分析，該化合物的分子式為C12H8O4，相對(duì)分子質(zhì)量理論值為217.048 9、實(shí)測(cè)值為217.049 54，誤差為2.95 ppm。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，防風(fēng)中含有花椒毒素，其相對(duì)分子質(zhì)量為217，因此判斷該化合物為花椒毒素，峰4的MS/MS圖見圖5。

2.4.5 補(bǔ)骨脂素 峰5的tR為8.5 min，ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z=187[M+H]+，脫去一分子CO2形成特征碎片m/z=143[M+H-CO2]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=115[M+H-CO2-CO]+；準(zhǔn)分子離子峰分別脫去一分子、兩分子、三分子CO形成特征碎片m/z=159[M+H-CO]+、m/z=131[M+H-2CO]+、m/z=103[M+H-3CO]+，再脫去一分子C2H2形成碎片離子m/z=77[M+H-3CO- C2H2]+。根據(jù)元素組成分析和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，推斷該化合物分子式為C11H6O3，相對(duì)分子質(zhì)量理論值為187.038 05、實(shí)測(cè)值為187.038 97，誤差為4.92 ppm。且峰5的裂解規(guī)律與補(bǔ)骨脂素對(duì)照品相似，可以確定該化合物為補(bǔ)骨脂素，峰5和補(bǔ)骨脂素對(duì)照品的MS/MS圖見圖6。

2.4.6 Ostenol 峰6的tR為10.2 min，ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z=231[M+H]+，脫去一分子C3H6形成特征碎片m/z=189[M+H-C3H6]+；準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子C4H8形成特征碎片m/z=175[M+H-C4H8]+，再分別脫去一分子、兩分子、三分子CO形成特征碎片m/z=147[M+H-C4H8-CO]+、m/z=119[M+H-C4H8-2CO]+、m/z=91[M+H-C4H8-3CO]+。根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C14H14O3；相對(duì)分子質(zhì)量理論值為231.101 21、實(shí)測(cè)值為231.101 57，誤差為1.56 ppm。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，防風(fēng)中含有Ostenol，其相對(duì)分子質(zhì)量為231，因此判斷該化合物可能為Ostenol，峰6的MS/MS圖見圖7。

2.4.7 秦皮啶 峰7的tR為10.4 min，ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z=223[M+H]+，相繼脫去一分子、兩分子甲基分別形成特征碎片m/z=208[M+H-CH3]+、m/z=193[M+H-2CH3]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=165[M+H-2CH3-CO]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=137[M+H-2CH3-2CO]+。根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C11H10O5；相對(duì)分子質(zhì)量理論值為223.062 66、實(shí)測(cè)值為223.060 1，誤差為-2.91 ppm。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7，17]，防風(fēng)中含有秦皮啶，其相對(duì)分子質(zhì)量為223，因此判斷該化合物可能為秦皮啶，峰7的MS/MS圖見圖8。

2.4.8 異歐前胡素 峰8的tR為12.5 min，ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z=271[M+H]+，脫掉兩分子CO獲得 m/z=215[M+H-CO]+離子；準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子C5H8形成特征碎片m/z=203[M+H-C5H8]+，再脫去一分子H2O形成特征碎片m/z=185[M+H-C5H8-H2O]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=157[M+H-C5H8-H2O-CO]+；準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子C5H8和一分子CO形成特征碎片m/z=175[M+H-C5H8-CO]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=147[M+H-C5H8-2CO]+。根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C16H14O4；相對(duì)分子質(zhì)量理論值為271.096 61、實(shí)測(cè)值為271.096 49，誤差為-0.44 ppm。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]，防風(fēng)中含有異歐前胡素，其相對(duì)分子質(zhì)量為271，因此推測(cè)該化合物可能為異歐前胡素，峰8的 MS/MS圖見圖9。

2.4.9 5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素 峰9的tR為12.9 min，ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z=233[M+H]+，脫去一分子甲基形成特征碎片m/z=218[M+H-CH3]+，連續(xù)再脫掉一分子、兩分子、三分子CO分別形成特征碎片m/z=190[M+H-CH3-CO]+、m/z=162[M+H-CH3-2CO]+、m/z=134[M+H-CH3-3CO]+，再脫去一分子H2O形成碎片m/z=116[M+H-CH3-3CO-H2O]+；準(zhǔn)分子離子峰直接脫去一分子甲基和一分子CO2形成特征碎片m/z=174[M+H-CH3- CO2]+；準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子甲基和四分子CO形成特征碎片m/z=106[M+H-CH3-4CO]+。根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C12H8O5；相對(duì)分子質(zhì)量理論值為233.044 41、實(shí)測(cè)值為233.044 45，誤差為-0.17 ppm。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，防風(fēng)中含有5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素，其相對(duì)分子質(zhì)量為233，因此推斷該化合物可能為5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素，峰9的MS/MS圖見圖10。

2.4.10 珊瑚菜素 峰10的tR為12.9 min，ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z=301[M+H]+，脫掉兩分子CO獲得m/z=245[M+H-2CO]+碎片；準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子甲基和兩分子CO形成特征碎片m/z=230[M+H-2CO-CH3]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=202[M+H-3CO-CH3]+；準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子C5H8形成特征碎片m/z=233[M+H-C5H8]+，再脫去一分子甲基形成特征碎片m/z=218[M+H-C5H8-CH3]+，再相繼脫去一分子、兩分子、三分子CO形成特征m/z=190[M+H-C5H8-CO- CH3]+、m/z=162[M+H-C5H8-2CO-CH3]+、m/z=134[M+H-C5H8-3CO-CH3]+。根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C17H16O5；相對(duì)分子質(zhì)量理論值為301.107 34、實(shí)測(cè)值為301.107 05，誤差為-0.96 ppm。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，防風(fēng)中含有珊瑚菜素，其相對(duì)分子質(zhì)量為301，因此推斷該化合物可能為珊瑚菜素，峰10的MS/MS圖見圖11。

2.4.11 紫花前胡素 峰11的tR為13.2min，ESI+模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z=329[M+H]+，脫去一分子C5H6O形成特征碎片m/z=247[M+H-C5H6O]+，再脫去一分子水形成碎片離子m/z=229[M+H-C5H6O-H2O]+，再脫去一分子甲基或一分子CO2分別形成m/z=214[M+H-C5H6O- H2O-CH3]+、m/z=185[M+H-C5H6O-H2O-CO2]+的特征碎片。根據(jù)元素組成分析，該化合物的分子式為C19H20O5；相對(duì)分子質(zhì)量理論值為329.138 35、實(shí)測(cè)值為329.138 35，誤差為0。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20]，防風(fēng)中含有紫花前胡素，其相對(duì)分子質(zhì)量為329，且在相同MS條件下峰11與紫花前胡素對(duì)照品的裂解規(guī)律一致，因此判斷該化合物為紫花前胡素，峰11和紫花前胡素對(duì)照品的MS/MS圖見圖12。

3 討論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)防風(fēng)藥材香豆素類成分進(jìn)行了全面分析，該方法具有高分離度、高分辨率、高質(zhì)量精度和高靈敏度等特點(diǎn)[21]。通過非目標(biāo)篩選并解析11個(gè)成分，理論相對(duì)分子質(zhì)量與實(shí)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量誤差均小于5 ppm。香豆素是繼色原酮后防風(fēng)藥材中另一主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其中的異歐芹素乙對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外釋放腫瘤壞死因子具有顯著的抑制作用[22]；傘形花內(nèi)酯、東莨菪素能明顯抑制組胺及蛋清誘發(fā)的大鼠足腫脹，其作用可持續(xù)4 h以上，均顯示出較強(qiáng)的抗炎活性[23]；補(bǔ)骨脂素、5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素對(duì)乳腺癌及前列腺癌細(xì)胞具有抗腫瘤作用，二者通過抑制線粒體脂質(zhì)過氧化來(lái)保護(hù)線粒體功能，均具有良好的抗氧化作用[24]；異歐前胡素具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，能明顯抑制熱板所致的小鼠疼痛[25]；紫花前胡素對(duì)脂多糖損傷的人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1具有保護(hù)作用，能夠降低炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）的分泌，對(duì)相關(guān)炎癥疾病具有保護(hù)作用[26]。

本研究作為防風(fēng)藥材質(zhì)量標(biāo)志物的前期研究，明確了防風(fēng)香豆素成分裂解規(guī)律，后期本課題組會(huì)繼續(xù)對(duì)防風(fēng)藥材的體內(nèi)入血成分進(jìn)行分析，并結(jié)合該結(jié)果進(jìn)一步確定防風(fēng)藥材的質(zhì)量標(biāo)志物，為防風(fēng)的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，并為闡明防風(fēng)道地性成因打下基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-07-27 修回日期：2018-11-28）

（編輯：林 靜）