松果菊苷對低壓低氧環(huán)境下小鼠空間認(rèn)知功能的改善作用及機制研究

鄭洪南 蘇鈺婷 赫雪鋒 王劍波

中圖分類號 R965 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）03-0328-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.10

摘 要 目的：研究松果菊苷（ECH）對低壓低氧環(huán)境下小鼠空間認(rèn)知功能的改善作用及其作用機制。方法：將60只小鼠隨機分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性組（銀杏葉提取物片，100 mg/kg）和ECH低、中、高劑量組（50、75、100 mg/kg），每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均飼養(yǎng)于低壓氧倉模擬低壓低氧，各組小鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d（給藥后立即放入低壓氧倉內(nèi)）；以2 min內(nèi)小鼠水平與垂直活動次數(shù)為指標(biāo)，評價其負(fù)面情緒與空間認(rèn)知功能；蘇木精-伊紅染色后顯微鏡觀察小鼠海馬組織病理學(xué)變化；并檢測小鼠海馬組織中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）的水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠水平活動次數(shù)、MDA水平均顯著增加/升高（P<0.05）；垂直活動次數(shù)，SOD、CAT、GSH-Px水平均顯著減少/降低（P<0.05）；海馬組織CA1區(qū)錐體細胞排列疏松，多數(shù)錐體細胞緊縮深染。與模型組比較，陽性組和ECH高劑量組小鼠水平活動次數(shù)、MDA水平顯著減少/降低（P<0.05）；垂直活動次數(shù)，SOD、CAT、GSH-Px水平顯著增加/升高（P<0.05）；海馬組織CA1區(qū)錐體細胞數(shù)量豐富，排列緊密，少量錐體細胞緊縮深染。結(jié)論：ECH對低壓低氧環(huán)境下小鼠空間認(rèn)知功能障礙具有一定的改善作用，其機制可能與升高海馬組織中SOD、CAT、GSH-Px水平及降低MDA水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 松果菊苷；低壓低氧；空間認(rèn)知功能；海馬組織；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improving effects of echinacoside （ECH） on spatial cognitive function in mice under hypobaric hypoxia environment and its mechanism. METHODS： Totally 60 mice were randomly divided into blank group （normal saline）， model group （normal saline）， positive group （Ginkgo leaf extract tablet，100 mg/kg） and ECH low-dose， medium-dose and high-dose groups （50， 75， 100 mg/kg）， with 10 mice in each group. Except for blank group， other groups were cultured in hypobaric oxygen chamber to simulate hypobaric hypoxia； they were given relevant medicine intragastrically once a day， for consecutive 7 d （Placing into hypobaric oxygen chamber immediately after medication）. Using the times of horizontal and vertical activities of mice in 2 min as index， negative emotions and spatial cognitive function were evaluated. Histopathological changes of hippocampus in mice were observed by microscopy after HE staining. The levels of SOD， CAT， GSH-Px and MDA in hippocampal tissue of mice were detected. RESULTS： Compared with blank group， the times of horizontal activities， MDA level were increased significantly in model group （P<0.05）， while the times of vertical activities， the levels of SOD， CAT and GSH-Px were decreased significantly （P<0.05）； the pyramidal cells in the CA1 area of the hippocampal tissue were arranged loosely， and many pyramidal cells were compressed and stained deeply. Compared with model group， the times of horizontal activities and MDA level were decreased significantly in positive group and ECH high-dose group （P<0.05）， while the times of vertical activities， the levels of SOD， CAT and GSH-Px were increased significantly （P<0.05）； the pyramidal cells in the CA1 region of the hippocampal tissue were abundant and closely arranged， and a few of them are constricted and deeply stained. CONCLUSIONS： ECH can improve spatial cognitive impairment of mice under hypobaric hypoxia environment， the mechanism of which may be associated with up-regulation of SOD， CAT and GSH-Px， down-regulation of MDA in the hippocampal tissue.

KEYWORDS Echinacoside； Hypobaric hypoxia； Spatial cognitive function； Hippocampal tissue； Mice

高原低壓低氧環(huán)境對人體的各種機能有不同程度地?fù)p傷，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）對低壓低氧尤為敏感，海馬區(qū)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中空間認(rèn)知功能最為密切的腦部區(qū)域；腦部功能的正常運轉(zhuǎn)需要消耗機體大約20%的氧氣，在低壓低氧環(huán)境中暴露能引起海馬組織的氧化應(yīng)激損傷，從而造成認(rèn)知功能障礙[1-3]。在高原低壓低氧條件下，極易使機體產(chǎn)生一系列生理及心理的變化，如損傷空間認(rèn)知能力，衰退記憶能力，出現(xiàn)眩暈、頭痛、惡心、嘔吐、反應(yīng)遲鈍等一系列反應(yīng)。松果菊苷（Echinacoside， ECH） 是從管花肉蓯蓉中提取分離的一種天然化合物[4]。研究表明，ECH可以提高人體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px） 的活性以及降低自由基損傷不飽和脂肪酸生成的脂類過氧化分解產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量，從而達到神經(jīng)保護的作用[5]，其還具有抗神經(jīng)細胞凋亡、抗炎、抗腫瘤和改善學(xué)習(xí)記憶能力以及免疫調(diào)節(jié)[6-7]等一系列作用。但是，對在高原低壓低氧的條件下引起的負(fù)面情緒增長與空間認(rèn)知探索能力減退，ECH是否依然可以起到保護作用尚不明確。本實驗通過使用低壓氧艙模擬低壓低氧環(huán)境，觀察ECH對低壓低氧環(huán)境下小鼠的行為學(xué)以及海馬組織形態(tài)學(xué)的影響，并初步研究其對小鼠空間認(rèn)知功能改善作用的機制。

1 材料

1.1 儀器

小型低壓低氧艙（空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程系自制）；7420動物行為學(xué)分析儀（意大利Ugo公司）；Microfuge 20高速低溫離心機（美國Bio-Rad公司）；BX-51光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；A6半自動生化儀（北京松上技術(shù)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)品（西安昊軒生物科技有限公司，批號：S-003-20170119，純度：99.43%）；銀杏葉提取物片（德國威瑪舒培博士藥廠，批號：1041216，含銀杏葉黃酮苷24%、萜類內(nèi)酯6%）；SOD（批號：20171228）、CAT（批號：20171203）、GSH-Px（批號：20180102）、MDA（批號：20171211）試劑盒均購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.3 動物

SPF級C57小鼠60只，♂，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2014-002。實驗期間小鼠自由飲食水，飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為21～23 ℃，相對濕度為40%～60%，明暗各12 h交替。

2 方法

2.1 分組與給藥

將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機分成空白組、模型組、陽性組和ECH高、中、低劑量組，每組10只。ECH高、中、低劑量組（100、75、50 mg/kg）[8-10]，空白組和模型組給予等體積生理鹽水，陽性組參照銀杏葉提取物片說明書中小鼠藥理毒理實驗研究給予100 mg/kg。除空白組外，其余各組均放置于模擬6 100 m海拔低壓低氧倉中飼養(yǎng)，自由飲食和水，每天早上8：00灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.2 小鼠負(fù)面情緒與空間認(rèn)知功能評價

灌胃給藥7 d后，采用動物行為學(xué)分析儀測試小鼠負(fù)面情緒與空間認(rèn)知能力。首先將每只小鼠置于黑暗環(huán)境中適應(yīng)5 min，然后將每只小鼠頭朝壁放入動物行為學(xué)分析儀中，記錄小鼠在2 min內(nèi)的水平與垂直活動次數(shù)，水平活動的情況體現(xiàn)小鼠的負(fù)面情緒，活動次數(shù)越多，負(fù)面情緒越大；垂直活動情況體現(xiàn)小鼠的空間探索能力，活動次數(shù)越多，空間認(rèn)知能力越強[11-12]。

2.3 小鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)觀察

行為學(xué)實驗結(jié)束后，各組取5只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，暴露出小鼠胸腔，手術(shù)剪從小鼠的左心室心尖插入到主動脈，剪開心耳，用40 mL生理鹽水沖洗，再用4%多聚甲醛40 mL灌注后，立即斷頭；在冰上迅速取腦，放入4%的多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋，切成10 μm薄片，行蘇木精-伊紅（HE）染色[13-14]，使用光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化。

2.4 小鼠海馬組織SOD、CAT、GSH-Px、MDA水平的測定

將各組剩余的5只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，按“2.3”項下“暴露出小鼠胸腔……用40 mL生理鹽水沖洗”處理后立即斷頭，在冰上迅速取腦，剝離小鼠海馬組織，生理鹽水清洗后用濾紙吸干多余水分，于離心管中凍存過夜。次日取出復(fù)蘇解凍，稱取0.1 g放入玻璃勻漿管口剪碎，加入9 倍體積的生理鹽水進行勻漿，制成10%的勻漿液，然后在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，檢測SOD、CAT、GSH-Px、MDA的水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠負(fù)面情緒與空間認(rèn)知功能評價結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠水平活動次數(shù)顯著增加（P<0.05），垂直活動次數(shù)顯著減少（P<0.05）。與模型組比較，ECH高劑量組、陽性組水平活動次數(shù)顯著減少（P<0.05），ECH高劑量組和陽性組垂直活動顯著增加（P<0.05）。結(jié)果表明，ECH可明顯改善低壓低氧所致的小鼠負(fù)面情緒，提高其空間認(rèn)知能力。各組小鼠水平與垂直活動次數(shù)見表1。

3.2 小鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

各組小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖1。

如圖1所示，與空白組比較，模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列疏松，多數(shù)錐體細胞緊縮深染。與模型組比較，陽性組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列較緊密，少量錐體細胞緊縮深染，ECH高劑量組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)量豐富，排列緊密，極少量錐體細胞緊縮深染，ECH中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列較緊密，少量錐體細胞緊縮深染，ECH低劑量組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列較疏松，較多錐體細胞緊縮深染。

3.3 小鼠海馬組織中SOD、CAT、GSH-Px、MDA水平檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠海馬組織中SOD、CAT、GSH-Px水平均顯著降低（P<0.05），MDA水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽性組和ECH高劑量組小鼠海馬組織中SOD、CAT、GSH-Px水平均顯著升高（P<0.05），MDA水平均顯著降低（P<0.05）；ECH中劑量組CAT水平顯著升高（P<0.05），MDA水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠海馬組織中SOD、CAT、GSH-Px、MDA水平測定結(jié)果見表2。

4 討論

有關(guān)研究表明，高原條件下的低氧可以誘導(dǎo)人高級神經(jīng)功能紊亂，從而導(dǎo)致人學(xué)習(xí)記憶能力衰退和動作的協(xié)調(diào)性降低等[15-17]。相關(guān)研究表明[18]，高原條件下大腦認(rèn)知功能損傷的作用機制可能與大腦海馬組織氧化應(yīng)激水平的改變有關(guān)。低壓低氧能夠引起小鼠的氧化應(yīng)激損傷從而導(dǎo)致腦部海馬組織的空間認(rèn)知功能障礙。急性低壓低氧是一種單因素溫和暴露刺激[19]，低氧可引起小鼠空間認(rèn)知功能的損害，并可引起小鼠活動量的異常[12，20]。低氧后小鼠水平活動度的增加可能與低氧引起運動皮層腦細胞組織的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有一定關(guān)聯(lián)，急性低壓低氧可降低小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機制可能與海馬細胞組織中SOD、CAT、GSH-Px、MDA水平變化有關(guān)[21-23]。

銀杏葉提取物是從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，主要成分為黃酮苷及銀杏內(nèi)酯，具有強抗氧化和清除自由基活性作用[24]，主要用于治療腦部、周圍血流循環(huán)障礙等[25]。ECH具有多種功效，如抗氧化、抗炎、護肝、保護神經(jīng)、改善學(xué)習(xí)記憶以及免疫調(diào)節(jié)等[26]，尤其是在保護抗氧化應(yīng)激損傷水平上具有巨大的潛力，其分子結(jié)構(gòu)中含有的苯丙烯基和苯乙醇基，均帶有鄰位酚羥基，具有清除活性氧、自由基的作用[27-28]，因此，推測其可能對大腦海馬組織具有保護作用[29-30]。本實驗結(jié)果也證明ECH可以減少小鼠負(fù)面情緒（水平活動次數(shù)），并同時提高小鼠空間認(rèn)知能力（垂直活動的次數(shù)）；HE染色結(jié)果也表明，ECH可減輕低壓低氧對小鼠海馬組織錐體細胞的損傷。

綜上所述，ECH對低壓低氧環(huán)境下小鼠空間認(rèn)知障礙具有明顯的改善作用，其作用機制可能與上調(diào)海馬組織中SOD、CAT、GSH-Px水平以及下調(diào)MDA水平有關(guān)，該實驗結(jié)果可為后續(xù)ECH的臨床應(yīng)用提供參考。

參考文獻

[ 1 ] 高鈺琪，牛文忠，謝印芝，等.高原軍事醫(yī)學(xué)[M].重慶：重慶出版社，2005：549.

[ 2 ] MAITI P， SINGH SB， MALLICK B， et al. High altitude memory impairment is due to neuronal apoptosis in hippocampus，cortex and striatum[J]. J Chem Neuroanat，2008，36（4）：227-238.

[ 3 ] MAITI P， MUTHURAJU S， ILAVAZHAGAN G，et al. Hypobaric hypoxia induces dendritic plasticity in cortical and hippocampal pyramidal neurons in rat brain[J]. Behav Brain Res，2008，189（2）：233-243.

[ 4 ] LI XH， GOU CY， YANG HS， et al. Echinacoside ameliorates D-galactosamine plus lipopolysaccharide-induced acute liver injury in mice via inhibition of apoptosis and inflammation[J]. Scand J Gastroenterol，2014，49（8）：993-1000.

[ 5 ] PELLATI F， BENVENUTI S， MAGRO L， et al. Analysis of phenolic compounds and radical scavenging activity of Echinacea spp.[J]. J Pharm Biomed Anal，2004，35（2）：289-291.

[ 6 ] DENG M， ZHAO JY， TU PF， et al. Echinacoside rescues the SHSY5Y neuronal cells from TNF alpha-induced apoptosis[J]. Eur J Pharmacol，2004，505（3）：11-18.

[ 7 ] GUSTAVO C. ROMAN. Facts， myths， and controversies in vascular dementia [J]. J Neurol Sci，2004，226（1/2）：49-52.

[ 8 ] PENG L，DAN Z， MANTIAN M，el a1. Quercetin ameliorates hypobaric hypoxia-induced memory impairment through mitochondrial and neuron function adaptation via the PGC-1-pathway[J]. Restor Neurol Neurosci，2015.DOI：10.3233/RNN-140446.

[ 9 ] 駱新，李建英，陶義存，等.肉蓯蓉苯乙醇苷對大鼠高原腦水腫的防治作用[J].中南藥學(xué)，2014，8（12）：747-750.

[10] 田楓，張闊，鄭振輝，等.松果菊苷改善SAM-P/8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力作用機制初探[J].實驗動物科學(xué)與管理，2006，2（23）：14-15.

[11] DUSEK JA，EICHENBAUM H. The hippocampus and memory for orderly stimulus relations[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（13）：7109-7l14.

[12] LEVSHINA IP，MATS VN，PASIKOVA NV，et al. Comparison of the behavior of rats after immobilization with structural changes in the motor cortex[J]. Neurosci Behav Physiol，2009，39（9）：915-919.

[13] 姚茹，張銳虎，陳朝陽，等.蓮心堿對佛波酯所致耳腫脹炎癥模型小鼠的抗炎作用及機制研究[J].中國藥房，2018，29（17）：2364-2368.

[14] 鄭偉，海軍，杜立學(xué)，等.甲基蓮心堿對肝缺血再灌注損傷模型小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響[J].中國藥房，2018，29（15）：2068-2072.

[15] XIAO J， HUANG Y， LI X. TNP-ATP is beneficial for treatment of neonatal hypoxia-induced hypomyelination and cognitive decline[J]. Neurosci Bull，2016，32（1）：99- 107.

[16] WEI B， LI L， HE A. Hippocampal NMDAR-Wnt- Catenin signaling disrupted with cognitive deficits in adolescent offspring exposed to prenatal hypoxia[J]. Behav Brain Res，2016.DOI：10.1016/j.brainres.2015.11.041.

[17] PAVILCEK V， SCHINLO C，NEDEL A， et al. Cognitive and emotional processing at high altitude[J]. Aviat Space Environ Med，2005，76（1）：28-33.

[18] MAITI P，SINGH S B，MALLICK B，et al. High altitude memory impairment is due to neuronal apoptosis in hippocampus，cortex and striatum[J]. J Chem Neuroanat，2008，36（3/4）：227-238.

[19] 尉曉娜，謝于鵬.低氧對小鼠曠場行為的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，42（1）：17-18.

[20] DUSEK JA， EICHENBAUM H. The hippocampus and memory for orderly stimulus relations[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（13）：7109-7114.

[21] 林建雄，隋建峰.急性低壓低氧對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響及與海馬內(nèi)孤啡肽的關(guān)系[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2004，20（1）：12-13.

[22] SHUKITT HB， STILLMAN MJ， WELCH DI， el al. Hypobsric hypoxia impairs spatial memory in an elevation- dependent fashion[J]. Behav Neural Biol，1994，62（3）：244-252.

[23] ABD-ELHADY RM， ELSHEIKH AM， KHALIFA AE. Anti-amnestic properties of ginkgo biloba extract on impaired memory function induced by aluminum in rats[J]. Int J Dev Neurosci，2013，31（7）：598-607.

[24] 王曉霞，王穎超，趙明.銀杏葉提取物對糖尿病外周血內(nèi)皮祖細胞超氧化物歧化酶及凋亡的影響[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25（3）：244-248.

[25] 李洋，洪莉，劉成，等.松果菊苷藥理作用研究進展[J].藥學(xué)進展，2017，36（1）：56-60.

[26] 古力努爾·木特列夫，雷麗，屠鵬飛，等.松果菊苷抗衰老作用機制研究[J].生物物理學(xué)報，2004，20（3）：183-187.

[27] 劉曉明，崔曉燕，甄曉蘭.黃芩提取物對阿爾茨海默病模型小鼠的抗氧化作用[J].中國藥房，2015，26（19）：2651-2653.

[28] CERVELLATI R， RENZULLI C， GUERRA MC， et al. Evaluation of antioxidant activity of some natural polyphenolic compounds using the briggs-rauscher reaction method[J]. J Agric Food Chem，2002，50（26）：7504-7509.

[29] HU C，KITTS DD.Studies on the antioxidant activity of echinacea root extract[J]. J Agric Food Chem，2000，48 （5）：1466-1472.

（收稿日期：2018-09-21 修回日期：2018-11-22）

（編輯：唐曉蓮）