黃芪飲片中黃芪甲苷含量檢測(cè)方法的改進(jìn)

賈福懷,陸 偉,涂宏建,熊菲菲,陳 磊,雷 蕾

(寧波御坊堂生物科技有限公司,浙江 寧波315012)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹等功效,主產(chǎn)于甘肅、內(nèi)蒙古、山西等地[1]。黃芪甲苷Astragaloside IV是黃芪增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的主要活性成分之一,屬于四環(huán)三萜類皂苷,具有良好的免疫調(diào)節(jié)、器官保護(hù)、改善心肌能量代謝、消炎抗病毒等功效,已成為評(píng)價(jià)黃芪藥材及其制劑質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要標(biāo)準(zhǔn)之一[2-4]。近年來越來越多的文獻(xiàn)針對(duì)黃芪甲苷的提取純化、含量檢測(cè)、藥理作用、機(jī)制研究和應(yīng)用研究等方面進(jìn)行了詳細(xì)的報(bào)道[5-9]。因此,建立一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定、靈敏度高、特異性強(qiáng)的含量測(cè)定方法,可以為黃芪甲苷的后續(xù)相關(guān)研究及功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。目前,黃芪甲苷含量檢測(cè)的方法較多,主要包括薄層掃描法、熒光分光光譜法、HPLC-UV/ELSD、質(zhì)譜法和近紅外波譜法等[10-12]。中華人民共和國(guó)藥典(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2015版中采用甲醇溶液索氏提取,正丁醇和氨試劑萃取,D101型大孔吸附樹脂凈化以及HPLC-ELSD檢測(cè)法,對(duì)黃芪藥材中的黃芪甲苷進(jìn)行定量檢測(cè),該方法中儀器檢測(cè)部分較為穩(wěn)定,但樣品前處理部分具有耗時(shí)長(zhǎng)、人為操作誤差較大、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性不佳等缺點(diǎn)。相關(guān)文獻(xiàn)針對(duì)其前處理方法也進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化和改進(jìn)[13-15],但總體效果一般。本研究采用甲醇回流提取和超聲提取相結(jié)合的混合提取方式,HPLC-ELSD儀器檢測(cè)方法,既簡(jiǎn)化了相應(yīng)的前處理步驟,縮短處理時(shí)間,提高檢測(cè)效率,又提高了樣品中黃芪甲苷的提取效率,從而使檢測(cè)結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 HPLC高效液相色譜儀；Alltech 3300 ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；國(guó)華電器HH-4水浴鍋；KH-260DB超聲清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；D101大孔吸附樹脂柱(柱內(nèi)徑1.5 cm,長(zhǎng)12cm)；普析超純水機(jī)等。

1.2 樣品與試劑

黃芪樣品：亳州永剛飲片廠(批號(hào)：171124；180402；2018040303,產(chǎn)地均為甘肅)；亳州普仁中藥飲片廠(批號(hào)：1804081,產(chǎn)地甘肅)。甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；正丁醇(分析純)；氨水(分析純)；水(超純水)等。黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,含量96.9%,批號(hào)：110781-201717)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-ELSD色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動(dòng)相：ACN∶H2 O＝32∶68,等度洗脫；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10μL；ELSD氣化溫度：90℃；氮?dú)饬髁浚?.8 L/min；增益∶1；運(yùn)行時(shí)間：45 min。數(shù)據(jù)結(jié)果計(jì)算方法：外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)方程法。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解稀釋成每1.0mL含0.12mg和0.48mg的溶液,即得2種不同濃度的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 將黃芪藥材或飲片粉碎,過四號(hào)篩,備用。

方法1：2015版《中國(guó)藥典》方法：稱取4 g左右黃芪粉末,精密稱定,置于索氏提取器中。加甲醇40 mL,冷浸過夜。加熱回流4 h,提取液濃縮至干后加水10 mL,微熱溶解。用水飽和的正丁醇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇溶液。用氨試液洗滌2次,每次40 mL,棄去氨試液,正丁醇溶液蒸干,加5 mL水溶液,通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm,柱高12 cm)。用水50 mL,40%的乙醇溶液30 mL依次洗滌,棄去洗滌液。繼用70%乙醇溶液80 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干。甲醇溶解,置于10 mL容量瓶中定容、搖勻。HPLC-ELSD測(cè)定,進(jìn)樣前樣品溶液用0.45μm有機(jī)系濾膜過濾。

方法2：與方法1同至“正丁醇溶液蒸干”,加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容。HPLC-ELSD測(cè)定,進(jìn)樣前樣品溶液用0.45μm有機(jī)系濾膜過濾。

方法3：稱取4g左右黃芪粉末,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加入甲醇80mL,冷浸過夜。70℃加熱回流4.0 h后,靜置5min,取上清液過濾。濾液于65℃旋蒸至干,加15mL熱水溶解。用水飽和的正丁醇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇提取溶液。用氨試液洗滌2次,每次50 mL,棄去氨試液,正丁醇溶液在85℃下旋蒸至干,殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,加甲醇定容,0.45μm濾膜過濾后即得樣品溶液。

方法4：稱取4g左右黃芪粉末,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加甲醇80 mL,冷浸過夜。30℃,100 W功率超聲30 min,靜置5 min后取上清液過濾。殘?jiān)尤爰状?0 mL后再次超聲提取,重復(fù)3次后合并甲醇溶液,從“濾液于65℃旋蒸至干”開始,與方法3相同操作。

方法5：稱取4g左右黃芪粉末,精密稱定,置于圓底燒瓶中。加入甲醇80mL,冷浸過夜。70℃加熱回流1.5h后,靜置5 min,取上清液過濾。殘?jiān)尤爰状?0 mL,30℃,100 W功率超聲15min。靜置5 min后取上清液過濾,重復(fù)超聲步驟2次。合并甲醇提取溶液,從“濾液于65℃旋蒸至干”開始,與方法3相同操作。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精確配制 0.06 mg/mL、0.12 mg/mL、0.24mg/mL、0.48mg/mL、0.96 mg/mL、1.92 mg/mL一系列濃度的黃芪甲苷對(duì)照品溶液,按照上述“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)試,記錄不同濃度黃芪甲苷對(duì)照品色譜峰面積。以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),獲得線性回歸方程：Y＝1.672X＋3.544,r＝0.999 8。數(shù)據(jù)表明黃芪甲苷在0.06～1.92 mg/mL濃度范圍內(nèi),進(jìn)樣溶液濃度的對(duì)數(shù)與峰面積的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系,表明本方法適用于黃芪甲苷定量分析檢測(cè)。

2.4 樣品溶液穩(wěn)定性考察

在常溫、避光放置的條件下,取本品方法5制備的供試品溶液,分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h進(jìn)樣10μL注入Agilent HPLC 1260儀器中,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定黃芪甲苷的色譜峰面積,7次測(cè)定的色譜峰面積RSD為1.87%,表明供試品溶液在常溫避光環(huán)境中12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 儀器精密度考察

使用液相色譜儀重復(fù)6次測(cè)定黃芪甲苷對(duì)照品溶液,每次精密吸取濃度為0.48 mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液10μL,收集色譜峰面積,結(jié)果RSD為0.76%。表明本HPLC-ELSD方法儀器精密度良好。

2.6 不同方法比較

取同一批黃芪飲片(批號(hào)：永剛180402),按照“2.2.2”項(xiàng)下的5種不同前處理方法進(jìn)行黃芪甲苷檢測(cè)方法研究,每種方法各重復(fù)5次。詳細(xì)數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。分析總結(jié)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),我們可以發(fā)現(xiàn)：①按照方法1(2015版《中國(guó)藥典》方法),前處理步驟繁瑣,人為操作引入的誤差較大,導(dǎo)致重現(xiàn)性差；同時(shí)耗時(shí)較長(zhǎng),冷浸過夜之后前處理時(shí)間仍需8 h左右。②對(duì)比方法1、2數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)樹脂凈化除雜的過程會(huì)造成黃芪甲苷的大量損失,含量檢測(cè)結(jié)果明顯偏低。潘細(xì)貴等[16]也已通過實(shí)驗(yàn)證明：使用D101型大孔吸附樹脂在黃芪總皂苷凈化除雜過程中,即使采用少量低濃度乙醇(15%)清洗樣品,也能洗脫部分黃芪總皂苷,并隨著濃度的增大而增大。同時(shí)D101型大孔吸附樹脂也會(huì)對(duì)黃芪總皂苷進(jìn)行一定的殘留吸附,難以洗脫。由此可見柱層析凈化過程將會(huì)對(duì)黃芪甲苷的含量造成不可避免的損失。③通過使用柱效較高的反相色譜柱結(jié)合高靈敏的ELSD檢測(cè)器,已足夠分離黃芪供試品中的雜質(zhì)干擾,而無需采用樹脂凈化除雜的過程。采用上述“2.1”色譜方法,針對(duì)未過柱的黃芪供試品溶液分析,發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷主峰的理論塔板數(shù)達(dá)18 000,與最近的雜質(zhì)峰的分離度達(dá)2.62,且峰型對(duì)稱,拖尾因子為0.95,完全滿足定量分析條件。因此,大孔吸附樹脂除雜過程可以省去,不會(huì)對(duì)定量檢測(cè)造成影響,詳細(xì)色譜見圖1。④索氏提取、回流提取、超聲提取間具有一定的差異：索氏提取操作復(fù)雜,效率低；回流提取的提取率相較于超聲和索氏提取稍高；超聲提取操作簡(jiǎn)便,處理時(shí)間短,但提取效率偏低；⑤改進(jìn)后的方法5,通過結(jié)合加熱回流和超聲提取兩種提取方法。不僅縮短了提取步驟和時(shí)間,冷浸過夜之后前處理時(shí)間縮短到4 h之內(nèi),相較與藥典方法縮短了一半左右。同時(shí),提高了提取效率,檢測(cè)結(jié)果顯示方法5處理后的提取液中黃芪甲苷含量最高。⑥對(duì)比5種前處理方法平行實(shí)驗(yàn)的RSD數(shù)據(jù)：方法5＜方法3＜方法4＜方法2＜方法1,發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后的方法5簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟,增強(qiáng)了可操作性,提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。

圖1 黃芪甲苷HPLC-ELSD色譜

表1 不同提取方法測(cè)定黃芪樣品中黃芪甲苷含量結(jié)果 (n＝5)

續(xù)表1 不同提取方法測(cè)定黃芪樣品中黃芪甲苷含量結(jié)果 (n＝5)

2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱定5份4 g左右的黃芪粉末樣品(批號(hào)：永剛180402,含量通過方法5已測(cè)定為0.076 4%)。分別精密加入0.48 mg/mL的黃芪對(duì)照品2.0 mL進(jìn)行加標(biāo),按照“2.2.2”項(xiàng)中的方法5步驟進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)過程并計(jì)算回收率,結(jié)果平均回收率為100.16%,5次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的RSD值為2.63%,表明加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好,改進(jìn)后的方法5能夠針黃芪飲片中的黃芪甲苷進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

為驗(yàn)證“2.2.2”項(xiàng)中方法5的實(shí)用性,我們針對(duì)4批亳州飲片公司購(gòu)買的黃芪飲片進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果良好,含量均符合2015版《中國(guó)藥典》中規(guī)定的黃芪甲苷要求含量0.040%。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同批次飲片之間黃芪甲苷含量差異明顯,說明不同批次的黃芪藥材之間質(zhì)量差異較大。通過改變方法中的稱樣量(提取物稱樣量為2.5g左右),本方法也適用于黃芪水提提取物中黃芪甲苷的含量測(cè)定。結(jié)果見表3。

表3 黃芪飲片及水提提取物中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究建立了一種加熱回流提取結(jié)合超聲提取的混合提取前處理方法,通過高靈敏的HPLC-ELSD儀器檢測(cè),針對(duì)黃芪飲片及其水提提取物中黃芪甲苷的含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。相比于2015版《中國(guó)藥典》中的檢測(cè)方法,混合提取模式不僅縮短了提取時(shí)間,提高黃芪甲苷的提取率和檢測(cè)的效率,而且通過省略大孔樹脂的凈化過程,減少前處理步驟,降低了檢測(cè)成本,從而明顯提高了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。本改進(jìn)方法可以作為黃芪藥材、飲片、提取物和中成藥中黃芪甲苷質(zhì)量的檢測(cè)方法,同時(shí)也可以為后續(xù)黃芪甲苷相關(guān)功效研究及功能性食品開發(fā)提供依據(jù)。