姜 嫄,張長(zhǎng)海
(1.黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州 興義562400;2.黔西南州人民醫(yī)院,貴州 興義562400)
魚金注射液(YJI)是一種純中藥注射劑[1],由魚腥草、金銀花提取制成,具有抗炎、解熱及抗菌等作用。在臨床上療效可靠,可用于急性上呼吸道感染、急性支氣管炎、支氣管肺炎等病的治療,顯著改善發(fā)熱、咳嗽、氣急等癥狀,其主要用藥方式包括肌肉注射、穴位注射和霧化吸入[2-4]。目前,尚無(wú)針對(duì)魚金注射液對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)臟器功能影響的報(bào)道。有研究通過(guò)檢索2010年底前相關(guān)文獻(xiàn)分析魚金注射液用藥情況、不良反應(yīng)涉及系統(tǒng)和表現(xiàn)對(duì)其安全性與有效性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示,共獲取有效文獻(xiàn)69篇,1篇橫斷面研究和臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)報(bào)道提示魚金注射液具有較好的臨床療效,25例報(bào)道不良反應(yīng),分別表現(xiàn)為皮疹12例,過(guò)敏性休克4例,注射部位疼痛3例,其他輸液或過(guò)敏反應(yīng)6例[5]。但由于資料所限,仍不足判定魚金注射液有效性及安全性。
脾臟是機(jī)體重要的免疫器官,內(nèi)含大量B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,是機(jī)體參與細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫的重要場(chǎng)所[6]。同時(shí),脾臟也是紅細(xì)胞、白細(xì)胞和粒細(xì)胞生成、貯存與成熟的主要器官。魚金注射液功效與其主要成分清熱解毒類中藥魚腥草和金銀花調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能相關(guān),研究表明,二者均可通過(guò)增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬能力、促進(jìn)干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)表達(dá)[7],增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。有研究者將一定比例的魚腥草與吉富羅非魚構(gòu)成共生系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)其可顯著提高吉富羅非魚膽汁液及血清中金屬硫蛋白(MT)、免疫球蛋白(IgM)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的含量,從而提高吉富羅非魚非特異免疫能力,并發(fā)現(xiàn)這種效應(yīng)與魚腥草根系通過(guò)化感作用分泌的黃酮類等物質(zhì)相關(guān)[8-9]。魚腥草提取物可通過(guò)增強(qiáng)脾臟Th1類細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12基因表達(dá),抑制Th2類細(xì)胞因子IL-4基因表達(dá)促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫,調(diào)節(jié)感染雞毒支原體雞胚模型免疫功能,抑制雞毒支原體感染[7]。研究表明,每日灌胃給予大鼠金銀花煎劑2.5 g·kg-1,2周,可顯著提高大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù),能增強(qiáng)機(jī)體脾臟Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α能力及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能,增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒,抗胞內(nèi)菌感染的能力[10]。金銀花多糖可提高免疫低下小鼠的脾臟指數(shù),增加血清溶血素抗體生成及IL-2含量,增強(qiáng)環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的免疫功能[11]。金銀花黃酮能顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟器指數(shù)、脾臟超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力,明顯降低脾臟單胺氧化酶和丙二醛含量,具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能[12]。胃是機(jī)體重要的消化器官。中醫(yī)認(rèn)為胃主受納與腐熟,賴于胃脘之陽(yáng)的溫化,過(guò)用寒涼之品則易損傷胃陽(yáng),使胃失和降而致胃脘痞滿、消化不良等。魚金注射液成分金銀花、魚腥草均屬于清熱解毒類中藥,性偏寒。本實(shí)驗(yàn)以臨床等效用量50、100倍的魚金注射液分別作為低、高劑量組,以大鼠為研究對(duì)象,探討魚金注射液對(duì)大鼠脾、胃功能及形態(tài)的影響,為魚金注射液臨床使用劑量、時(shí)間等提供相應(yīng)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
清潔級(jí)SD大鼠共60只,雌雄各半,體重:(80±20)g,購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(軍)2012-0011。
魚金注射液產(chǎn)自朗致集團(tuán)萬(wàn)榮藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z14021872,批號(hào)17060621E)。
采血針(南昌市贛達(dá)醫(yī)療器械有限公司,批號(hào):170905);采血管(南昌市贛達(dá)醫(yī)療器械有限公司,批號(hào)180529);采血管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司,批號(hào)171012);多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20180112);高效切片石蠟(上海華靈康復(fù)器械廠,批號(hào)20180118);無(wú)水乙醇(AR級(jí))(江蘇海興化工有限公司,批號(hào)GB678-90);PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)ZLI-9062);二甲苯(AR級(jí))(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20180110);伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司,批號(hào)BA-4099);蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司,批號(hào)BA-4097);中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20171009);鹽酸(AR級(jí))(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)20180118);濃硫酸:(AR級(jí))(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)20180119);重鉻酸鉀:(AR級(jí))(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)20180120);xt2000i血常規(guī)儀(西斯美康);u5800全自動(dòng)生化儀(貝克曼);組織包埋盒(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司,批號(hào)31050102W);R35刀片(日本羽毛安全剃刀株式會(huì)社);BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠);轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)徠卡-2016);TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司);PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司);BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國(guó) Media Cybernetics公司)。
60只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為3組,每組20只,雌雄各半。分別為:正常組、魚金注射液低劑量組(2 mL·kg-1)、魚金注射液高劑量組(4mL·kg-1),正常組灌胃給予生理鹽水2mL·kg-1,給藥組分別灌胃給予魚金注射液2 mL·kg-1、魚金注射液4mL·kg-1,每天灌胃給藥1次,連續(xù)給藥5周。
給藥期間觀察大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)質(zhì)量、活動(dòng)情況、進(jìn)食情況,監(jiān)測(cè)大鼠體重變化。并選取給藥第1、7、14、21、28、35 d大鼠體重做柱狀圖比較每組各時(shí)間點(diǎn)體重差異。
取大鼠新鮮脾臟,使用生理鹽水將其沖洗干凈,分別稱取脾臟濕重,計(jì)算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾重(mg)/體重(g)。
摘眼球采集大鼠血液,全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)大鼠全血紅細(xì)胞 (RBC)、血紅蛋白 (Hb)、紅細(xì)胞壓積 (HCT)、白細(xì)胞 (WBC)、血小板 (PLT)計(jì)數(shù);以2 500 rpm·min-1,4℃離心15 min后吸取血清,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血清血糖(GLu)、總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)含量。
取大鼠新鮮脾臟和胃組織適當(dāng)大小迅速放入4%多聚甲醛中,固定,石蠟包埋,切片,HE染色,采用BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集,每張切片先于40倍下觀察全部組織,觀察大體病變,選擇要觀察的區(qū)域采集100、400倍圖片并分析。
所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與正常組比較,魚金注射液低、高劑量組雄性與雌性大鼠各時(shí)間段體重均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見(jiàn)圖1。魚金注射液低、高劑量組大鼠被毛柔順有光澤,反應(yīng)靈敏,活動(dòng)度可,體重增加明顯,食欲良好,大便呈顆粒狀,與正常組大鼠無(wú)明顯差異。
圖1 魚金注射液對(duì)大鼠體重變化的影響
與正常組比較,魚金注射液低、高劑量組雄性與雌性大鼠各時(shí)間段食物利用率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。
圖2 魚金注射液對(duì)大鼠食物利用率的影響
與正常組比較,魚金注射液低、高劑量組雄性與雌性大 鼠脾臟指數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。
表1 魚金注射液對(duì)大鼠脾臟指數(shù)影響 (±s,n=10)
表1 魚金注射液對(duì)大鼠脾臟指數(shù)影響 (±s,n=10)
組別 劑量(mL·kg-1) 雄性體重(g) 脾臟指數(shù)(mg·g-1)雌性體重(g) 脾臟指數(shù)(mg·g-1)正常組 - 213.69±27.82 2.61±0.31 209.56±24.65 2.55±0.19魚金注射液低劑量組 2 210.78±18.54 2.66±0.37 203.31±21.69 2.58±0.27魚金注射液高劑量組 4 212.42±15.55 2.71±0.42 210.62±18.05 2.67±0.41
與正常組比較,魚金注射液低高劑量組雄性與雌性大鼠血清血糖(GLu)、總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。
表2 魚金注射液對(duì)大鼠血清血糖、總膽固醇、甘油三酯影響 (±s,mmol·L-1,n=10)
表2 魚金注射液對(duì)大鼠血清血糖、總膽固醇、甘油三酯影響 (±s,mmol·L-1,n=10)
組別 劑量(mL·kg-1)雄性CHOL TG GLU雌性CHOL TG GLU正常組 - 1.81±0.06 1.50±0.18 10.34±1.29 1.81±0.15 1.58±0.32 10.14±1.39魚金注射液低劑量組 2 1.86±0.08 1.50±0.07 10.19±0.86 1.74±0.20 1.60±0.51 10.95±2.27魚金注射液高劑量組 4 1.85±0.11 1.49±0.15 10.65±0.87 1.82±0.15 1.65±0.29 10.91±2.94
與正常組比較,魚金注射液低高劑量組雄性與雌性大鼠紅細(xì)胞 (RBC)、血紅蛋白 (Hb)、紅細(xì)胞壓積 (HCT)、白細(xì)胞 (WBC)、血小板 (PLT)計(jì)數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、表4。
表3 魚金注射液對(duì)大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)影響 (±s,n=10)
表3 魚金注射液對(duì)大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)影響 (±s,n=10)
組別 劑量(mL·kg-1)雄性RBC(?10^12·L-1)HGB(g·L-1)HCT(%)雌性RBC(?10^12·L-1)HGB(g·L-1)HCT(%)正常組 - 6.23±0.20 157.10±7.39 46.70±4.67 6.84±0.74 151.40±9.58 46.50±3.21魚金注射液低劑量組 2 6.18±0.58 155.90±6.08 49.30±4.99 6.86±0.64 150.20±5.12 46.20±5.01魚金注射液高劑量組 4 6.39±0.33 156.80±4.76 47.60±4.27 6.93±0.45 149.80±6.00 46.30±4.27
表4 魚金注射液對(duì)大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)影響 (±s,n=10)
表4 魚金注射液對(duì)大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)影響 (±s,n=10)
組別 劑量(mL·kg-1) 雄性WBC/109·L-1 PLT/109·L-1雌性WBC/109·L-1 PLT/109·L-1正常組 - 11.16±0.87 829.10±71.58 11.40±0.77 810.80±94.35魚金注射液低劑量組 2 10.85±0.45 823.40±49.57 11.23±0.92 818.00±51.08魚金注射液高劑量組 4 11.10±0.56 847.30±87.45 10.80±0.63 819.50±66.80
正常組雄雌性大鼠脾臟:脾臟被膜完整,紅髓和白髓分界較為清晰,白髓區(qū)域脾小結(jié)可見(jiàn)生發(fā)中心較明顯,淋巴細(xì)胞排列較疏松,巨噬細(xì)胞增多,呈現(xiàn)“星空現(xiàn)象”,即有大而不規(guī)則、淺染的巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片形成,核分裂象增多,淋巴細(xì)胞數(shù)量減少;紅髓區(qū)域內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn),巨噬細(xì)胞增多;其他未見(jiàn)明顯病理變化。魚金注射液低劑量組脾臟:脾臟被膜完整,紅髓和白髓分界較為清晰,白髓區(qū)域脾小結(jié)可見(jiàn)生發(fā)中心較明顯,淋巴細(xì)胞排列較疏松,巨噬細(xì)胞增多,呈現(xiàn)“星空現(xiàn)象”,即有大而不規(guī)則、淺染的巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片形成,核分裂象增多,淋巴細(xì)胞數(shù)量減少;紅髓區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)少量嗜酸性或中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),巨噬細(xì)胞明顯增多;其他未見(jiàn)明顯病理變化。魚金注射液高劑量組雄性及雌性大鼠脾臟:脾臟被膜完整,紅髓和白髓分界較為清晰,白髓區(qū)域脾小結(jié)可見(jiàn)生發(fā)中心較明顯,淋巴細(xì)胞排列較疏松,巨噬細(xì)胞增多,呈現(xiàn)“星空現(xiàn)象”,即有大而不規(guī)則、淺染的巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片形成,核分裂象增多,淋巴細(xì)胞數(shù)量減少;紅髓區(qū)域內(nèi)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),巨噬細(xì)胞增多;其他未見(jiàn)明顯病理變化。魚金注射液低高劑量組雄性及雌性大鼠脾臟組織鏡下所見(jiàn)與正常組比較無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖3、圖4。
圖3 魚金注射液對(duì)雄性大鼠脾組織病理檢測(cè)(HE染色)結(jié)果左(×100)、右(×400)
圖4 魚金注射液對(duì)雌性大鼠脾組織病理檢測(cè)(HE染色)結(jié)果左(×100)、右(×400)
如圖5、圖6所示,正常組雄性及雌性大鼠胃組織可見(jiàn)纖維組織增生及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);黏膜肌層組織松散,其他未見(jiàn)明顯病理變化。魚金注射液低劑量組雄性及雌性大鼠胃:黏膜單層柱狀上皮、固有層及黏膜肌層結(jié)構(gòu)完好,無(wú)壞死脫落、增生腸化及鱗狀化生;固有層內(nèi)部分壁細(xì)胞空泡變性,未見(jiàn)明顯的纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn);其他未見(jiàn)明顯病理變化。魚金注射液高劑量組雄性及雌性大鼠胃:黏膜單層柱狀上皮、固有層及黏膜肌層結(jié)構(gòu)完好,無(wú)增生腸化及鱗狀化生;固有層內(nèi)部分壁細(xì)胞空泡變性,部分細(xì)胞壞死,未見(jiàn)明顯的纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn);黏膜下層可見(jiàn)中度水腫;其他未見(jiàn)明顯病理變化。見(jiàn)圖5、圖6。
圖5 魚金注射液對(duì)雄性大鼠胃組織病理檢測(cè)(HE染色)結(jié)果左(×100)、右(×400)
圖6 魚金注射液對(duì)雌性大鼠胃組織病理檢測(cè)(HE染色)結(jié)果左(×100)、右(×400)
續(xù)圖6 魚金注射液對(duì)雌性大鼠胃組織病理檢測(cè)(HE染色)結(jié)果左(×100)、右(×400)
關(guān)于魚金注射液中藥制劑研究截止目前為止只有藥效的研究并沒(méi)有關(guān)于毒性研究的報(bào)道。由于效-毒二重性是藥物作用的基本特性 因此筆者認(rèn)為有必要進(jìn)行魚金注射液“功效-毒性”相關(guān)性的研究,即在已經(jīng)進(jìn)行其功效研究的同時(shí)重點(diǎn)考察其毒副作用的表達(dá),不能孤立地“就功效論功效,就毒性論毒性”。魚金注射液是魚腥草與金銀花提取而成的復(fù)方注射制劑,功效清熱解毒,與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能密切相關(guān)[7-12]。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官,免疫器官的質(zhì)量在一定程度上可以反映免疫器官內(nèi)的淋巴細(xì)胞數(shù)量,從而間接地了解體內(nèi)淋巴細(xì)胞總體水平[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,魚金注射液低、高劑量組雄性與雌性大鼠脾臟指數(shù)與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HE染色病理結(jié)果顯示,正常組雌性及雄性大鼠脾臟被膜完整,紅髓和白髓分界較為清晰,白髓區(qū)域脾小結(jié)可見(jiàn)生發(fā)中心較明顯,淋巴細(xì)胞排列較疏松,巨噬細(xì)胞增多,呈現(xiàn)“星空現(xiàn)象”,即有大而不規(guī)則、淺染的巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片形成,核分裂象增多,淋巴細(xì)胞數(shù)量減少;紅髓區(qū)域內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn),巨噬細(xì)胞增多;其他未見(jiàn)明顯病理變化。魚金注射液低、高劑量組雄性及雌性大鼠脾臟病理變化與正常組無(wú)明顯差異。魚金注射液低、高劑量組雄性與雌性大鼠RBC、Hb、HCT、WBC、PLT計(jì)數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外,本試驗(yàn)部分動(dòng)物脾臟組織均出現(xiàn)不同程度的脾小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞減少,巨噬細(xì)胞增多,少量中性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),可能是由于環(huán)境等因素所引起的應(yīng)激反應(yīng),為非特異性病變。
胃是機(jī)體重要的消化器官。中醫(yī)認(rèn)為胃主受納與腐熟,賴于胃脘之陽(yáng)的溫化,過(guò)用寒涼之品則易損傷胃陽(yáng),使胃失和降而致胃脘痞滿、消化不良等。魚金注射液成分金銀花、魚腥草均屬于清熱解毒類中藥,性偏寒。本實(shí)驗(yàn)魚金注射液低、高劑量組分別相當(dāng)于臨床等效用量的50、100倍,用藥5周后各項(xiàng)指標(biāo)顯示:魚金注射液低、高劑量組雄性與雌性大鼠被毛柔順有光澤,反應(yīng)靈敏,活動(dòng)度可,食欲良好,食物利用隨鼠齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),但各時(shí)間段組間食物利用率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖2),體重增加明顯,且組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖1),大便呈顆粒狀,血清GLu、CHOL、TG含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2),與正常組大鼠無(wú)明顯差異,表明各組大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好。正常組雄性及雌性大鼠胃組織可見(jiàn)纖維組織增生及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜肌層組織松散,這與魚金注射液高劑量組雄性及雌性大鼠胃黏膜下層所見(jiàn)中度水腫均考慮為灌胃所造成的物理?yè)p傷。另外,本試驗(yàn)光鏡觀察部分動(dòng)物胃組織可見(jiàn)少量胃腺內(nèi)壁細(xì)胞空泡變性等病理改變,固有層中少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)嗜堿性顆粒存在,可能為解剖時(shí)動(dòng)物禁食不夠,導(dǎo)致肝臟內(nèi)肝糖原含量過(guò)高導(dǎo)致。
本實(shí)驗(yàn)分別灌胃給予SD大鼠別相當(dāng)于人體推薦劑量50倍和100倍的魚金注射液,持續(xù)5周,結(jié)果未見(jiàn)脾胃功能發(fā)生明顯異常改變,表明魚金注射液安全性較佳,但就其調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能來(lái)說(shuō),本課題將深入研究魚金注射液對(duì)感染模型脾臟各項(xiàng)指標(biāo)的影響觀察其具體機(jī)制。此課題的開(kāi)展不僅填補(bǔ)了魚金注射液在運(yùn)用中對(duì)毒副作用說(shuō)明的缺失,同時(shí)也有利于此藥在臨床運(yùn)用中的標(biāo)準(zhǔn)化,為魚金注射液臨床使用劑量、時(shí)間等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為魚金注射液在臨床上的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。