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    藏藥康珠甘露口服固體前體脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化研究

    2019-10-19 03:53:12林靈敏卓小月蔣孝龍
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2019年9期
    關(guān)鍵詞:卵磷脂水合保護(hù)劑

    孟 達(dá),毛 羽,林靈敏,卓小月,蔣孝龍

    (西南民族大學(xué) 藥學(xué)院,四川 成都610041)

    藏藥降糖復(fù)方(康珠甘露)是本課題組在傳統(tǒng)民族藥方劑基礎(chǔ)上化裁而來,用于二型糖尿病治療及心腦血管保護(hù),康珠甘露總黃酮提取物(ZYZH)為其主要有效成分,ZYH為其中一種主要黃酮苷成分,為康珠甘露的評價(jià)指標(biāo)和主要有效成分,其作用機(jī)制為對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用[1-3],增加胰島素的敏感性,改善胰島素抵抗及相關(guān)代謝紊亂[4,5]。

    本實(shí)驗(yàn)以ZYZH為原料開展深度研究,針對ZYZH溶解度低,首過效應(yīng)明顯,口服生物利用度差的特點(diǎn),將其制備成一種新型的前體脂質(zhì)體制劑,使其不但具備脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn),并能克服傳統(tǒng)脂質(zhì)體劑型貯存穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)[6-8],一方面可以提高藥物的溶出;另一方面最終增加ZYZH總黃酮在胃腸道的跨膜吸收和口服生物利用度。

    本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)和前期實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上,分別采用載體沉積法[9]和冷凍干燥法[10]制備藏藥康珠甘露總黃酮口服固體前體脂質(zhì)體,以包封率為評價(jià)指標(biāo),采用單因素考察和正交試驗(yàn)法,優(yōu)化ZYZH前體脂質(zhì)體制備工藝,并對兩種制備方法進(jìn)行對比研究,為藏藥康珠甘露的后期制劑研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器

    AL104電子分析天平,英國malvern公司;JSM-7500F掃描電鏡,日本電子株式會(huì)社;MS-2000激光粒度分析儀,英國malvern公司;SENCO-R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申申科技有限公司;Waters2695高效液相色譜儀,美國Waters;FD-1冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;KQ250B超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司。

    1.2 藥品及試劑

    ZYZH原料藥(由西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所提供,含量≥60%);ZYH對照品(由西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所提供,批號20150508,經(jīng)核磁和質(zhì)譜鑒定,采用HPLC法測定,經(jīng)面積歸一化法計(jì)算純度大于98%);山梨醇、氯化鈉、乳糖、乙醇、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、海藻糖、蔗糖、膽固醇、氯仿、大豆卵磷脂、維生素E、磷酸氫二鉀、SephadexG-50、磷酸二氫鉀、三氯甲烷,以上試劑均為分析純,甲醇(色譜純),均由成都市科龍化工試劑廠提供。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 載體沉積法制備ZYZH前體脂質(zhì)體

    取處方量載體粉末置于1 000 mL茄形瓶中,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以80~90 rpm轉(zhuǎn)速、水浴恒溫40℃的條件,減壓預(yù)熱30 min。取處方量ZYZH原料藥、大豆卵磷脂、膽固醇適當(dāng)超聲和溫?zé)崾谷苡谶m量有機(jī)溶劑(氯仿∶甲醇)中,以1.0 mL/min加入上述有機(jī)混合液,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。有機(jī)混合液全部加入后,繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30~40 min,將粉末置于真空干燥器中12h后過篩(40目),即得ZYZH前體脂質(zhì)體。

    2.2 冷凍干燥法制備ZYZH前體脂質(zhì)體

    稱取處方量大豆卵磷脂、膽固醇、ZYZH原料藥置于1 000 mL茄形瓶中,加入適量有機(jī)溶劑(氯仿∶甲醇),超聲使其充分溶解。于40℃水浴減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑,形成均勻透明的薄膜,加入10 mL(PBS)作為水合介質(zhì)進(jìn)行洗脫,于40℃恒溫水浴水化2 h,水浴超聲30 min,得到乳狀半透明ZYZH脂質(zhì)體懸浮液,密封置于4℃下冷藏保存。

    采用冷凍干燥法制備前體脂質(zhì)體。以甘露醇為凍干保護(hù)劑,利用制備得到ZYZH脂質(zhì)體懸浮液,加入凍干保護(hù)劑濃溶液,使得混合后凍干劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%(由加入保護(hù)劑的質(zhì)量除以混合液的體積計(jì)算得來),將其冷凍干燥即得ZYZH前體脂質(zhì)體。得到的凍干樣品密封、避光,常溫保存于干燥器中。

    2.3 ZYZH前體脂質(zhì)體包封率的測定方法

    按照本實(shí)驗(yàn)前期所建立的SephadexG-50柱分離法,測定方法簡述如下:稱取一定量的Sap HadexG-50(100~200μm),用緩沖溶液室溫浸泡24 h后裝柱,精密吸取一定量脂質(zhì)體樣品上樣,控制流速在0.8~1mL/min,用PBS洗脫,收集前10mL含脂質(zhì)體的初洗脫液(a),另取與上樣量同體積的脂質(zhì)體混懸液,用10 mL PBS稀釋,得未分離溶液(b)。分別取a、b溶液用無水乙醇稀釋至澄明,超聲破膜,進(jìn)樣,測定其峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度和含藥量。a溶液測得的藥物濃度記作C包裹,b溶液測得的藥物濃度記作C總。

    2.4 影響前體脂質(zhì)體制備的因素考察

    2.4.1 不同載體對載體沉積法制備ZYZH前體脂質(zhì)體包封率的影響 固定其他因素不變,分別選用氯化鈉、山梨醇、乳糖為載體,制備前體脂質(zhì)體,用PBS水合后測定其粒徑分布、Zeta電位及包封率。結(jié)果包封率分別為60.3%、62.1%、59.3%。表明載體為山梨醇時(shí),制備的脂質(zhì)體包封率最高。

    2.4.2 進(jìn)樣速度對載體沉積法制備ZYZH前體脂質(zhì)體包封率的影響 固定其他因素不變,載體為山梨醇時(shí):考察進(jìn)樣速度分別為0.6 mL/min、1.0 mL/min、1.4 mL/min,制備ZYZH前體脂質(zhì)體,用PBS水合后測定粒徑分布、Zeta電位及包封率。結(jié)果包封率分別為60.3%、62.1%、59.3%。結(jié)果表明,進(jìn)樣速度為1.0 mL/min時(shí),制備的脂質(zhì)體包封率最高。

    2.4.3 冷凍干燥法制備ZYZH前體脂質(zhì)體時(shí)凍干保護(hù)劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)以凍干后外觀形狀、水合難易程度及包封率為指標(biāo)對不同凍干保護(hù)劑,如山梨醇、乳糖、蔗糖及海藻糖制備的ZYZH前體脂質(zhì)體進(jìn)行了考察。結(jié)果以海藻糖、乳糖作為凍干保護(hù)劑制備的前體脂質(zhì)體水合效果最優(yōu)。

    2.4.4 冷凍干燥法制備ZYZH前體脂質(zhì)體時(shí)凍干保護(hù)劑量的考察 本實(shí)驗(yàn)以凍干后外觀形狀、水合難易程度及包封率為指標(biāo)考察了磷脂與凍干保護(hù)劑(w/w)不同比例制備的前體脂質(zhì)體,比例分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。結(jié)果表明,當(dāng)卵磷脂與海藻糖的比例(w/w)為1∶4時(shí)所制得的前體脂質(zhì)體包封率最高。

    2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

    以包封率作為主要指標(biāo),結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,對水浴溫度(A),載脂比(w/w)(B),膽固醇與卵磷脂比例(w/w)(C),藥物與卵磷脂比例(w/w)(D),4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平實(shí)驗(yàn),選用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn),制備ZYZH前體脂質(zhì)體,測定包封率。結(jié)果見表1。

    表1 載體沉積法正交試驗(yàn)結(jié)果

    續(xù)表1 載體沉積法正交試驗(yàn)結(jié)果

    從表中可按極差R值大小排序,D>B>A>C,即藥物與卵磷脂的質(zhì)量比是影響包封率照A2B1C3D2組合制備的ZYZH前體脂質(zhì)體,復(fù)水后的包封率為67.7%,優(yōu)于其他組合的包封率。因此水浴溫度為40℃,進(jìn)樣速度為1.0 mL/min、卵磷脂與載體的質(zhì)量比為1∶4,卵磷脂與膽固醇的比例為5∶1,藥物與卵磷脂質(zhì)量比為1∶10為最優(yōu)處方。

    以包封率作為主要指標(biāo),結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,對干燥工藝中凍干保護(hù)劑的用量(A)、預(yù)凍時(shí)間(B)及預(yù)凍溫度(C),3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn),制備ZYZH前體脂質(zhì)體,并測定包封率。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2。

    表2 冷凍干燥法正交試驗(yàn)結(jié)果

    從表中可知按極差R值大小排序,C>B>A,即預(yù)凍溫度是影響包封率的主要因素。且按照A1B3C2組合制備的ZYZH前體脂質(zhì)體,復(fù)水后的包封率為62.1%,包封率優(yōu)于其他組合。因此,卵磷脂與凍干保護(hù)劑的比例為1∶3,預(yù)凍時(shí)間為20 h,預(yù)凍溫度為-50℃,此為最優(yōu)條件。

    由表1、表2可以看出,采用山梨醇載體沉積法制備的ZYZH包封率大于冷凍干燥法制備前體脂質(zhì)體的包封率。

    2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

    綜合對比工藝優(yōu)化結(jié)果,山梨醇載體沉積法制備ZYZH前體脂質(zhì)體優(yōu)于冷凍干燥法。最終按山梨醇載體沉積法最優(yōu)處方及工藝制備3批ZYZH前體脂質(zhì)體,產(chǎn)品為淺黃色具一定流動(dòng)性的粉末。測定其包封率分別為67.1%、67.5%、67.2%。由測定結(jié)果可知此處方和制備條件穩(wěn)定可行。

    2.6 ZYZH前體脂質(zhì)體的質(zhì)量評價(jià)

    2.6.1 形態(tài)和粒徑 兩種方法所制備的ZYZH前體脂質(zhì)體形態(tài)和粒徑,如表3所示。

    表3 梨醇載體沉積法和冷凍干燥法制備的ZYZH前體脂質(zhì)體形態(tài)和粒徑

    綜上所述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,載體沉積法在包封率、前體脂質(zhì)體固體形態(tài)及水化后脂質(zhì)體粒徑多方面指標(biāo)均優(yōu)于冷凍干燥法。

    圖1 載體沉積法脂質(zhì)體掃描電鏡

    圖2 冷凍干燥法脂質(zhì)體掃描電鏡

    2.6.4 ZYZH前體脂質(zhì)體初步穩(wěn)定性考察 在ZYZH前體脂質(zhì)體初步穩(wěn)定性考察中,以外觀色澤、水合難易程度及水合后粒徑、pH值、包封率等為指標(biāo),考察了ZYZH前體脂質(zhì)體在影響因素實(shí)驗(yàn)、留樣實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性,通過60℃高溫試驗(yàn)、4 000 LX強(qiáng)光照射試驗(yàn)、4℃留樣考察以及25℃室溫留樣考察來研究ZYZH前體脂質(zhì)體對溫度和光照強(qiáng)度的敏感性,以確保ZYZH前體脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和用藥安全性、有效性。

    按照最佳工藝制得的ZYZH前體脂質(zhì)體為淺黃色、流動(dòng)性良好的干燥顆粒,水合后成淺黃色脂質(zhì)體混懸液。將此混懸液密閉冰箱4℃條件放置1、2、4、6個(gè)月后仍未見分層現(xiàn)象。同時(shí)將ZYZH前體脂質(zhì)體在室溫密閉條件下放置1、2、4、6個(gè)月后,通過水合成混懸液并經(jīng)透射電鏡和粒度分析儀檢測,結(jié)果具有良好的囊泡結(jié)果且粒徑分布均勻。此結(jié)果顯示冷藏環(huán)境下的ZYZH脂質(zhì)體混懸液和室溫下的前體脂質(zhì)體在放置6個(gè)月后,各參數(shù)值無明顯變化,說明所研制的ZYZH前體脂質(zhì)體水合形成脂質(zhì)體混懸液具有較好的穩(wěn)定性。在60℃高溫條件及強(qiáng)光照射下,會(huì)使脂質(zhì)體少許結(jié)塊,水合難度相應(yīng)增加。建議將ZYZH前體脂質(zhì)體置于室溫(25℃)或低溫、避光保存。

    3 討論

    降糖藏藥康珠甘露總黃酮水溶性差,口服具有首過效應(yīng),如何提高黃酮苷類天然藥物的生物利用度,一直是藥劑學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)難題,為了提高其口服生物利用度,本實(shí)驗(yàn)采用前體脂質(zhì)體技術(shù)制備了一種新型的口服ZYZH固體前體脂質(zhì)體給藥系統(tǒng),以提高ZYZH的生物利用度。前體脂質(zhì)體在運(yùn)輸、儲(chǔ)存的過程中比起普通脂質(zhì)體有更好的穩(wěn)定性,可減少聚集、融合及藥物滲漏,但不同制備方法制備的脂質(zhì)體質(zhì)量不同,本實(shí)驗(yàn)采用載體沉積法和冷凍干燥法制備ZYZH前體脂質(zhì)體,以外觀、水合難易及包封率為指標(biāo)對兩種制備方法進(jìn)行了綜合比較分析,結(jié)果顯示載體沉積法制備的前體脂質(zhì)體總體結(jié)果較好。最終選用載體沉積法制備ZYZH前體脂質(zhì)體。通過單因素篩選及正交試驗(yàn)確立了載體沉積法的最佳處方為卵磷脂與載體的質(zhì)量比(w/w)為1∶4,卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(w/w)為5∶1,藥物與卵磷脂質(zhì)量比(w/w)為1∶10,PBS的pH值為7.0。并確定了相應(yīng)最佳制備工藝,本課題首次采用藏藥降糖復(fù)方(康珠甘露)有效部位提取物(總黃酮,ZYZH)進(jìn)行了治療糖尿病的前體脂質(zhì)體制劑的研究,成功制得了工藝合理可行、質(zhì)量穩(wěn)定可控的ZYZH前體脂質(zhì)體。

    在體外分析方法的建立過程中,本研究選用其中一種主要藥效成分ZYH為指標(biāo)并對其建立了有效、可行的含量測定方法。但中藥復(fù)方的藥效作用是由多種有效成分相互影響而發(fā)揮的,選用一種指標(biāo)成分進(jìn)行測定并不能全面反映所制備的制劑質(zhì)量可控性。后續(xù)工作應(yīng)對處方中其他有效成分進(jìn)行系統(tǒng)分析,建立多指標(biāo)成分的體外分析方法。

    在制備工藝方法篩選過程當(dāng)中,雖然本實(shí)驗(yàn)綜合對比結(jié)果表明載體沉積法優(yōu)于冷凍干燥法,但載體沉積法在工業(yè)化生產(chǎn)中有一定難度,且復(fù)水程度較冷凍干燥法差,兩種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的目的在于通過載體沉積法制備工藝的優(yōu)化進(jìn)而為以后的中試及工業(yè)生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

    由于時(shí)間關(guān)系,后續(xù)將進(jìn)一步完善其藥動(dòng)學(xué)研究,并考察其在體內(nèi)外的釋放、吸收及分布規(guī)律,目前本課題組正在開展生物等效性研究和長期影響因素試驗(yàn)。

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