青魚野生與養(yǎng)殖群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析

王 豐 張家華 沈玉幫 , 徐曉雁 , 王榮泉 李家樂 ,

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 上海201306; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306; 4. 蘇州市申航生態(tài)科技發(fā)展股份有限公司農(nóng)業(yè)部大宗淡水魚類繁育與健康養(yǎng)殖技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘇州 215221)

青魚(Mylopharyngodon piceus)是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類, 也是長江流域重要的漁業(yè)資源。隨著人類活動對環(huán)境的破壞和水利設(shè)施的建設(shè), 以及過度捕撈等情況的存在, 長江中的青魚資源遭到了嚴(yán)重的破壞[1], 青魚的數(shù)量也在急劇下降, 長江水產(chǎn)研究所對四大家魚早期資源的監(jiān)測顯示, 青魚的產(chǎn)卵量從1997年的7.68億粒下降到了2009年的2.90萬粒[1]。目前有關(guān)青魚遺傳多樣性的研究數(shù)量甚少,僅有少量基于蛋白質(zhì)遺傳多態(tài)[2]、線粒體基因[3,4]、微衛(wèi)星標(biāo)記[5]遺傳變異的報(bào)道。對于青魚微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā), 除了利用青魚作為樣本[6], 也有使用其他物種的微衛(wèi)星在青魚上進(jìn)行跨物種擴(kuò)增的報(bào)道[7]。

微衛(wèi)星標(biāo)記由于其具有高度的多態(tài)性, 在整個(gè)基因組中隨機(jī)分布, 數(shù)量十分豐富, 且具有較高的保守性, 為共顯性遺傳, 符合孟德爾遺傳定律, 較其他分子標(biāo)記具有更多的信息量[8], 因此被廣泛應(yīng)用于各種遺傳學(xué)相關(guān)研究中[9]。微衛(wèi)星標(biāo)記作為研究工具對水產(chǎn)動物的群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性分析、分子育種和種質(zhì)鑒定等方面[10,11]起到了重要的推動作用。

本研究使用自主開發(fā)的12對青魚微衛(wèi)星引物對收集到的 4個(gè)野生群體和1個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析, 以期為青魚種質(zhì)資源的評估和保護(hù)提供資料和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于遺傳分析的青魚樣本來源于國內(nèi)國家級四大家魚原良種場, 包括4個(gè)野生群體, 1個(gè)養(yǎng)殖群體。吳江養(yǎng)殖群體于2016年從江蘇吳江四大家魚良種場收集, 石首、邗江、嘉興、湘江野生群體于2017年分別從湖北石首老河長江四大家魚原種場、江蘇邗江長江系家魚原種場、浙江嘉興長江四大家魚原種場、湖南省魚類原種場收集, 具體位置和信息見表 1。采集其鰭條組織, 用無水乙醇固定, 在4 ℃冰箱中保存。

表 1 五個(gè)青魚群體采集信息Tab. 1 Sampling information of five populations of black carp

1.2 基因組DNA提取

本研究使用海洋生物基因組DNA快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)進(jìn)行DNA的提取, 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA是否降解, 用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo, 德國)檢測DNA純度和濃度, 然后將提取的DNA轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中, 用硅膠蓋封存, 置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增及分型

本研究所用的微衛(wèi)星標(biāo)記來自于自主開發(fā)的標(biāo)記, 引物由上海邁浦生物科技有限公司合成, 上游引物在5′端修飾FAM或HEX熒光基團(tuán)(表 2)。

PCR擴(kuò)增體系為25 μL (2×TaqMix 12.5 μL、10 μmol/L primer 1 μL、20 ng/μL DNA 1.5 μL和ddH2O 10 μL), 并調(diào)整合適的退火溫度以得到清晰和特異性高的條帶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性2min, 然后94℃變性30s、退火溫度30s、72℃延伸1min, 重復(fù)30次循環(huán), 最后72℃延伸10min。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf梯度PCR儀上進(jìn)行。

每個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)上機(jī), 采用的內(nèi)標(biāo)為ROX500, 由上海邁浦生物科技有限公司使用ABI3730XL全自動 DNA 測序儀進(jìn)行微衛(wèi)星分型, 獲得每個(gè)個(gè)體在不同位點(diǎn)上的等位基因數(shù)據(jù), 用Genemapper Version 4.0[12,13]軟件進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小的讀取。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小確定個(gè)體在該位點(diǎn)的基因型, 使用POPGEN32[14]計(jì)算得到各位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、近交系數(shù)(Fis)、種群間遺傳分化系數(shù)(FST)、種群間遺傳距離和各位點(diǎn)基因頻率等信息;用Cervus 3.0[15]計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC),及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)?；谌后w間的Nei’s遺傳距離使用MEGA 5.0構(gòu)建UPGMA 系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性

本實(shí)驗(yàn)共使用了12個(gè)位點(diǎn), 這12對微衛(wèi)星引物在5個(gè)青魚群體中各個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 分析擴(kuò)增結(jié)果得到了12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性信息(表 3)。分析結(jié)果顯示這12個(gè)位點(diǎn)在5個(gè)青魚群體中的等位基因數(shù)(Na)介于7—29, 有效等位基因數(shù)(Ne)介于3.347—13.730, 平均等位基因數(shù)和平均有效等位基因數(shù)分別為18.429和7.805, 其中MP20和MP65等位基因數(shù)最少都為7, MP54位點(diǎn)所具有的等位基因數(shù)最多為29。各位點(diǎn)的Shannon多樣性指數(shù)介于1.442—2.833, 觀測雜合度(Ho)介于0.623—0.937, 期望雜合度(He)介于0.703—0.929, 多態(tài)信息含量(PIC)介于0.660—0.923, 表明這12個(gè)位點(diǎn)均具有高度多態(tài)性(PIC＞0.5), 種群間遺傳分化系數(shù)(FST)介于0.034—0.173, Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)顯示有3個(gè)位點(diǎn)(MP40、MP49和MP62)極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)。

表 2 青魚12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星引物信息Tab. 2 12 pairs of Primers from black carp

2.2 青魚群體的遺傳多樣性

5個(gè)群體的遺傳多樣性信息如表 4所示, 結(jié)果顯示5個(gè)群體的平均等位基因數(shù)(Na)介于7.917—11.667,其中嘉興群體平均等位基因最少, 邗江群體最多;平均有效等位基因數(shù)(Ne)介于4.837—6.035, 其中石首群體最少, 邗江群體最多; 平均觀測雜合度介于0.713—0.861, 其中吳江群體最低, 嘉興群體最高;平均期望雜合度介于0.749—0.819, 其中湘江群體最低, 邗江群體最高; 平均多態(tài)信息含量介于0.711—0.788, 其中湘江群體最低, 邗江群體最高, 且多態(tài)信息含量的P值均大于0.5, 表明這5個(gè)群體均具有較高的遺傳多樣性。

5個(gè)群體Shannon多樣性指數(shù)(I)介于1.715—1.949, 其中石首群體最低, 邗江群體最高。除邗江群體相對稍高外, 其他各群體之間相差不大, 且5個(gè)群體的shannon多樣性指數(shù)從高到低排列依次為邗江＞吳江＞嘉興＞湘江＞石首, 與各群體平均有效等位基因數(shù)的大小順序相吻合, 說明在這5個(gè)青魚群體中, 邗江群體具有較高的等位基因豐富度, 而石首群體的等位基因豐富度相對較低。

表 3 青魚12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic diversity information of 12 microsatellites in black carp

表 4 青魚5個(gè)群體的遺傳多樣性Tab. 4 Genetic diversity of 5 populations in black carp

2.3 群體間遺傳分化及遺傳距離分析

根據(jù)12對引物的擴(kuò)增結(jié)果對5個(gè)青魚群體間的遺傳距離和遺傳相似度進(jìn)行了分析計(jì)算(表 5)。5個(gè)群體各群體間的遺傳距離介于0.207—0.875, 其中邗江群體和嘉興群體遺傳距離最小(0.207), 湘江群體和吳江群體遺傳距離最大(0.875)。各群體間的遺傳相似度介于0.417—0.813, 其中湘江群體和吳江群體遺傳相似度最小(0.417), 邗江群體和嘉興群體遺傳相似度最大(0.813)。

基于群體間Nei’s遺傳距離(DA)構(gòu)建UPGMA聚類樹如圖 1所示, 結(jié)果顯示邗江群體和嘉興群體首先聚為一支, 然后與石首和湘江兩個(gè)群體聚為一支,最后與吳江群體聚為一支。

3 討論

3.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)在群體中的遺傳多樣性水平

多態(tài)信息含量(PIC)是評價(jià)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重要參考標(biāo)準(zhǔn), 若PIC＞0.5表明該位點(diǎn)具有高度多態(tài)性,若0.25＜PIC＜0.5表明該位點(diǎn)具有中度多態(tài)性, 若PIC＜0.25表明該位點(diǎn)具有低度多態(tài)性。本研究所用的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因分布相對均勻, 所含等位基因數(shù)介于7—29, 平均多態(tài)信息含量在5個(gè)青魚群體中均在0.7以上, 觀測雜合度及期望雜合度均具有較高水平(Ho＞0.7,He＞0.7)。本實(shí)驗(yàn)中位點(diǎn)MP20在石首群體中(PIC=0.499)以及位點(diǎn)MP36和MP65在湘江群體中(PIC=0.444)表現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5), 但都接近0.5, 可能與所用群體該位點(diǎn)的多態(tài)性相對較低有關(guān), 另外采樣的隨機(jī)性以及群體數(shù)量的大小也可能對微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響, 從而導(dǎo)致在單一群體中位點(diǎn)多態(tài)性低于應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出的高多態(tài)性水平。

表 5 青魚5個(gè)群體的遺傳距離和遺傳相似度Tab. 5 Genetic distance and genetic similarity of 5 populations in black carp

圖 1 基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的5個(gè)青魚群體UPGMA聚類樹Fig. 1 UPGMA trees among 5 populations of black carp constructed based on Nei’s genetic distance

Guo等[7]利用草魚的微衛(wèi)星標(biāo)記在青魚群體中跨物種擴(kuò)增各位點(diǎn)擴(kuò)增所得的等位基因數(shù)在0—12不等, 分布十分不均勻, 而且許多位點(diǎn)擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為0或1, 大多小于5; 本研究中所用微衛(wèi)星標(biāo)記各位點(diǎn)在群體中擴(kuò)增所得的等位基因數(shù)明顯比之要多, 且均在5以上, 與之相比, 本研究和Zhu等[6]所用的微衛(wèi)星標(biāo)記在青魚群體中擴(kuò)增結(jié)果較為理想。

使用其他物種的微衛(wèi)星標(biāo)記跨物種擴(kuò)增可能出現(xiàn)無擴(kuò)增結(jié)果[16]、所得等位基因數(shù)低于預(yù)期、擴(kuò)增非同源產(chǎn)物[17]等問題, 這些問題可能會增加分析過程的復(fù)雜程度和降低研究結(jié)果的準(zhǔn)確性, 在使用中需要進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和驗(yàn)證, 而使用本物種所屬的微衛(wèi)星標(biāo)記則可以有效避免類似問題的出現(xiàn), 因此開發(fā)本物種的微衛(wèi)星標(biāo)記十分必要。

總體來說, 本研究所用的12個(gè)位點(diǎn)均具有較豐富的遺傳多樣性, 遺傳多樣性比較豐富, 可用于青魚的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳育種、遺傳多樣性分析等研究。

3.2 群體的遺傳多樣性水平

生物群體的遺傳多樣性是評價(jià)物種種質(zhì)資源狀況的重要依據(jù)之一。維持種內(nèi)的遺傳多樣性水平, 是種質(zhì)保護(hù)的最終目的, 也是種質(zhì)資源能持續(xù)利用的基礎(chǔ)。群體的有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度以及多態(tài)信息含量都是衡量群體遺傳多樣性的參考標(biāo)準(zhǔn), 群體的基因豐富度越高,將在這些方面表現(xiàn)出越高的數(shù)值[18]。在本研究中,5個(gè)青魚群體的平均觀測雜合度、平均期望雜合度以及平均多態(tài)信息含量的值均在0.7以上, 說明各群體的遺傳多樣性水平均處于較高水平。

方耀林等[19]用RAPD法對長江水系青魚遺傳多樣性進(jìn)行分析, 湘江群體的平均觀測雜合度為0.832, 其實(shí)驗(yàn)所用青魚湘江群體與本研究樣本同樣采集于長沙四大家魚原種場。在本研究中湘江群體的平均觀測雜合度為0.792, 與之相比稍低, 表明2004—2017年期間青魚湘江群體的遺傳多樣性可能有一定程度的降低; 在本研究中湖北石首群體平均觀測雜合度明顯低于其研究中湖北金口群體, 可能同樣存在遺傳多樣性降低的情況。但由于實(shí)驗(yàn)所用群體數(shù)量較少, 采樣時(shí)間跨度較長, 尚難以形成確定的結(jié)論, 還需進(jìn)行更多相關(guān)研究以進(jìn)行確認(rèn)。Hunter和Nico[5]報(bào)道了引入于美國密西西比河流域青魚的遺傳多樣性, 結(jié)果顯示期望雜合度平均為0.224, 遠(yuǎn)低于本研究, 可能是當(dāng)時(shí)引入的群體小和分析的樣本少的緣故。

等位基因在群體中分布的越均勻,Ne和Na就越接近[20], 在本研究中每個(gè)群體的Ne均小于Na, 群體的平均Ne小于Na, 主要是等位基因在群體中分布不均勻, 導(dǎo)致某些等位基因的頻率不夠平均。這說明各群體均存在等位基因分布不均勻的情況, 且不均勻程度吳江＞石首＞邗江＞湘江＞嘉興。

3.3 群體的遺傳結(jié)構(gòu)

基于群體間Nei’s遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類樹顯示嘉興群體和邗江群體首先聚為一支, 之后和石首群體和湘江群體聚為一支, 最后與吳江群體聚為一支。從地理分布上來說, 邗江和嘉興2個(gè)群體位于長江下游, 石首和湘江2個(gè)群體位于長江中游,這4個(gè)群體的遺傳距離和地理距離具有較強(qiáng)的相關(guān)性, 在聚類樹上表現(xiàn)出較為明顯的東西分布。但是同處長江下游的吳江群體與邗江和嘉興兩群體的遺傳距離反而較遠(yuǎn), 并且地理距離最近的吳江群體和嘉興群體的遺傳距離反而較遠(yuǎn), 結(jié)合采樣地點(diǎn)水域環(huán)境類型, 推斷可能與吳江群體所在水域存在太湖這一大面積湖泊環(huán)境, 而其他4個(gè)群體所在水域無類似水文環(huán)境, 從而導(dǎo)致吳江群體與其他4個(gè)群體產(chǎn)生了較大的遺傳分化。關(guān)于青魚多個(gè)群體的遺傳變異的研究目前僅見方耀林等[17]的研究, 但其所做研究僅涉及長江中游3個(gè)群體, 因此無法為該情況提供更多參考。在傅建軍等[21]的研究中, 在吳江、石首、邗江3個(gè)地區(qū)的草魚群體中, 吳江和邗江聚為一支, 石首與之聚為一支, 與本研究中情況并不相同。因此對于該情況, 尚需更多進(jìn)一步的研究。