腎癌組織中原鈣黏蛋白-10甲基化狀態(tài)及臨床意義

林英立 李艷麗 梁杰 趙炎

腎癌是泌尿系統(tǒng)中的常見腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，在組織學(xué)上以透明細(xì)胞癌為主[1-2]。腎癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制非常復(fù)雜，其中抑癌基因的失活起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谝职┗虻氖Щ钸^(guò)程中具有重要作用，包括DNA甲基化、組蛋白乙?；头蔷幋aRNA等；而DNA甲基化最為常見，可作為腫瘤早期診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物[3-5]。原鈣黏蛋白-10（PCDH10）是PCDH家族的一員，在細(xì)胞的正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤學(xué)研究表明，過(guò)表達(dá)的PCDH10具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，DNA甲基化是PCDH10失活的主要因素[6-7]。本研究對(duì)腎癌組織中PCDH10甲基化狀態(tài)及臨床意義作一探討。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2008年1月至2011年1月在本院接受腎癌根治術(shù)的78例腎癌患者為研究對(duì)象，其中男49例，女 29 例；年齡 55～78[66.5（61，72）]歲；參照 2010 年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）腎癌TNM分期：T138例，T217例，T320例，T43例；Fuhrman分級(jí)：G131例，G216例，G321例，G410例；局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次發(fā)現(xiàn)腎癌；（2）單一腎癌，未合并其他腫瘤；（3）術(shù)前影像學(xué)檢查診斷為腎臟惡性腫瘤，術(shù)后組織病理學(xué)診斷為透明細(xì)胞癌；（4）術(shù)前未接受過(guò)任何形式的抗腫瘤治療。所有患者隨訪至術(shù)后60個(gè)月或死亡，排除未能完成隨訪者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集 收集78例腎癌患者的癌組織標(biāo)本及其中38例T1期患者癌旁正常腎組織標(biāo)本（距離腫瘤邊緣2cm外）。所有標(biāo)本在術(shù)中切取，迅速置于液氮中，存于-80℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 DNA提取與甲基化特異性PCR（MSP） 使用Dneasy Tissue Kit（69504，德國(guó)Qiagen公司）并嚴(yán)格按照說(shuō)明書提取組織DNA。按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit（D5005，美國(guó)Zymo Research公司）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA亞硫酸氫鈉修飾并純化，分別應(yīng)用甲基化和非甲基化引物進(jìn)行PCR。甲基化引物：PCDH10正義5′-TCGTTAAATAGATACGTTACGC-3′，PCDH10 反義 5′-TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG-3′；非甲基化引物：PCDH10 正義 5′-GTTGTTAAATAGATATGTTATGT-3′，PCDH10 反義 5′-CTAAAAACTAAAAACTTTCCACA-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?95℃變性 30s，60℃退火 1min，72℃延伸30s；然后72℃延伸10min；最后4℃保溫[8-9]。反應(yīng)結(jié)束后取10μl產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像分析系統(tǒng)照相，結(jié)果以是否出現(xiàn)特異性甲基化或非甲基化條帶表示。僅應(yīng)用甲基化引物擴(kuò)增出產(chǎn)物條帶判斷為存在完全DNA甲基化，僅應(yīng)用非甲基化引物擴(kuò)增出產(chǎn)物條帶判斷為不存在DNA甲基化，若同時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶則表明存在部分DNA甲基化；完全DNA甲基化和部分DNA甲基化均被認(rèn)為DNA甲基化陽(yáng)性[8-9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)比較患者5年總生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎癌組織與癌旁正常組織中PCDH10甲基化陽(yáng)性率比較 腎癌組織PCDH10甲基化陽(yáng)性率為73.1%（57/78），明顯高于癌旁正常組織的 21.1%（8/38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腎癌組織PCDH10甲基化狀態(tài)的電泳圖，見圖1。

圖1 腎癌組織PCDH10甲基化狀態(tài)的電泳圖（例55、56、57出現(xiàn)甲基化；例58、59未出現(xiàn)甲基化；M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 腎癌組織PCDH10甲基化狀態(tài)與患者臨床特征的關(guān)系 腎癌組織PCDH10甲基化陽(yáng)性與患者性別、年齡無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與腫瘤T分期、Fuhrman分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 腎癌組織PCDH10甲基化狀態(tài)與患者臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 腎癌組織PCDH10甲基化與患者5年總生存率的關(guān)系 78例腎癌患者中，腎癌組織PCDH10甲基化57例，PCDH10非甲基化21例。甲基化組5年總生存率為73.7%（42/57），明顯低于非甲基化組的95.2%（20/21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），生存曲線見圖2。

3 討論

PCDH10基因位于人類染色體4q28.2，早期研究認(rèn)為其主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，參與神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞識(shí)別和神經(jīng)通路的形成等。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PCDH10在成人正常組織中廣泛表達(dá)，且在腫瘤組織中表達(dá)減少或缺失，對(duì)多種腫瘤具有抑癌基因的功能[6,10-11]。抑癌基因的失活具有多種機(jī)制，包括雜合性缺失、單倍體不足、基因印記、多態(tài)性和DNA甲基化等[12-13]。

圖2 腎癌組織PCDH10甲基化與未甲基化患者5年總生存率的生存曲線

DNA甲基化是最常見的一種表觀遺傳學(xué)改變。本研究所采用的MSP是目前應(yīng)用最廣泛的甲基化檢測(cè)方法，具有較高的靈敏度和特異度[14-15]。為研究PCDH10甲基化與腎癌發(fā)生的關(guān)系，筆者檢測(cè)了PCDH10在腎癌組織和癌旁正常腎組織中的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCDH10在腎癌組織中的甲基化陽(yáng)性率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PCDH10甲基化與腎癌的發(fā)生密切相關(guān)。一項(xiàng)基礎(chǔ)研究顯示，在肝癌細(xì)胞中上調(diào)PCDH10表達(dá)能抑制PI3K/Akt通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞增殖[10]；在多發(fā)性骨髓瘤的基礎(chǔ)研究中，也發(fā)現(xiàn)了PCDH10抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象[11]。DNA甲基化是PCDH10表達(dá)下調(diào)的主要原因。

有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、前列腺癌組織中PCDH10甲基化與患者腫瘤大小、分級(jí)和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，PCDH10甲基化是腫瘤進(jìn)展的促進(jìn)因素[7，9]。為探討腎癌組織PCDH10甲基化的臨床意義，筆者分析了PCDH10甲基化與患者性別、年齡、腫瘤T分期、Fuhrman分級(jí)和淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在T分期及Fuhrman分級(jí)較高、有淋巴轉(zhuǎn)移的患者中，PCDH10甲基化明顯增加。可見，PCDH10甲基化與腎癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。關(guān)于腎癌的預(yù)后，目前尚缺乏有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)，主要依靠臨床分期來(lái)預(yù)測(cè)患者的生存率，但其準(zhǔn)確性不能滿足臨床的要求。精確區(qū)分哪些患者在手術(shù)治療后預(yù)后較差、需要進(jìn)一步治療是目前臨床上急需解決的問(wèn)題。為進(jìn)一步探討腎癌組織PCDH10甲基化與患者預(yù)后的關(guān)系，筆者對(duì)腎癌患者進(jìn)行了5年術(shù)后隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCDH10甲基化組5年總生存率明顯低于未甲基化組，提示腎癌組織PCDH10甲基化陽(yáng)性與患者預(yù)后不良有關(guān)；這與乳腺癌、前列腺癌和淋巴瘤中的研究結(jié)果相似[7-8,16]。

綜上所述，腎癌組織PCDH10甲基化陽(yáng)性率較高，與腎癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后不良相關(guān)。PCDH10甲基化指標(biāo)有可能成為腎癌診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物。