冰片對(duì)替莫唑胺抗大鼠腦膠質(zhì)瘤促進(jìn)作用的研究

范成普 陳才紅 杜杭根 陳景南

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和病死率均較高。目前手術(shù)切除+放化療是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的最佳治療方式。由于血腦屏障的存在，化療藥物往往無(wú)法在腦內(nèi)達(dá)到一定濃度并直接作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤。目前研究證實(shí)，新型烷化劑——替莫唑胺具有良好的抗膠質(zhì)瘤作用[1]，臨床上廣泛用于成人頑固多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、復(fù)發(fā)或進(jìn)展的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或間變性星形細(xì)胞瘤的治療，但其在顱內(nèi)的濃度僅為血液的40%。冰片具有“芳香走竄、引藥上行”的功效，能增加血腦屏障的通透性，促進(jìn)其他物質(zhì)在腦組織聚集，增加血藥濃度[2-3]。本研究在大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型中聯(lián)合應(yīng)用冰片和替莫唑胺，以期通過(guò)冰片開(kāi)放血腦屏障，從而促進(jìn)替莫唑胺通過(guò)血腦屏障，提高腦組織內(nèi)藥物濃度，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 健康雄性Wistar大鼠26只（清潔、無(wú)特定病原級(jí)），體重220～240g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與儀器 冰片（100g，批號(hào)110743，杭州胡慶余堂）；替莫唑胺（100mg，批號(hào) H20130603，濟(jì)寧泰諾化工有限公司）；石蠟油500ml/瓶（南昌白云制藥公司）；0.9%氯化鈉溶液250ml/瓶（杭州民生制藥公司）；含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液（美國(guó) Gibco公司）；TUNEL試劑盒（德國(guó)Roche公司）；3%戊巴比妥鈉、蘇木素染液、伊紅染液、PBS（北京索萊寶科技有限公司）；10%多聚甲醛（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心自行配制）；切片石蠟（上海國(guó)藥有限公司）。腦立體定向儀（上海奧爾科特生物科技有限公司）；牙科鉆（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2235型，德國(guó)Leica公司）；病理組織漂烘儀（TEC2500型，常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取底面積75cm2的培養(yǎng)瓶數(shù)只，放入C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，再加入適量RPMI 1640培養(yǎng)液，輕輕混勻后置于培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至貼壁率＞80%時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以適量0.25%胰蛋白酶處理3～5min，棄消化液。用平衡鹽溶液進(jìn)行吹打，沖洗1～2次，形成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105個(gè)/μl，并使用該濃度的細(xì)胞懸液進(jìn)行接種。

1.4 模型制作 Wistar大鼠稱重后，以3%戊巴比妥鈉（1ml/100g）腹腔注射麻醉。取腦立體定向儀，固定大鼠頭部。在內(nèi)眥連線與頭部正中矢狀面交點(diǎn)處作一標(biāo)記，由此向后縱向切開(kāi)頭皮約lcm，分離暴露顱骨。根據(jù)Batker法，以冠狀縫前l(fā)mm、中線右旁開(kāi)3mm為右尾狀核點(diǎn)，使用牙科鉆在顱骨上鉆孔，直徑約1.2mm。使用微量注射器從培養(yǎng)基中抽取C6細(xì)胞懸液10μl，調(diào)節(jié)針尖，待觸及硬腦膜后沿鉆孔垂直進(jìn)針5mm，后退1mm，將細(xì)胞懸液緩慢、勻速注入到尾狀核內(nèi)，約10min。注射完畢后，留針5min退出，用明膠海綿填塞骨孔，外面骨蠟封閉。待大鼠蘇醒后，將其置于單籠環(huán)境飼養(yǎng)。造模第7天隨機(jī)選取6只大鼠斷頭取腦并分離腦組織，肉眼觀察腦組織表面未見(jiàn)明顯腫瘤組織；10%甲醛溶液固定，作石蠟切片，HE染色可見(jiàn)：腫瘤組織呈柵欄狀緊密排列，細(xì)胞核深染，與周圍的正常腦組織形成鮮明對(duì)比；正常腦組織與腫瘤組織之間可見(jiàn)一條較明顯的界線，存在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)及新生血管，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。提示建模成功。

1.5 分組與給藥 造模第14天按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。（1）冰片聯(lián)合替莫唑胺組：每只大鼠按3ml/kg灌服10%冰片石蠟油溶液，1h后按1ml/100g腹腔注射替莫唑胺溶液（替莫唑胺25mg/kg溶于相應(yīng)體積的0.5%羧甲基纖維素溶液中），1次/d，連續(xù)10d。（2）單用替莫唑胺組：每只大鼠按3ml/kg灌服0.9%氯化鈉溶液，1h后按上述方法腹腔注射替莫唑胺溶液，其余同上。（3）單用冰片組：每只大鼠按3ml/kg灌服10%冰片石蠟油溶液，1h后腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，其余同上。（4）空白對(duì)照組：每只大鼠按3ml/kg灌服0.9%氯化鈉溶液，1h后腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，其余同上。

1.6 一般情況觀察 每日觀察并記錄大鼠造模后精神、體重、飲食、活動(dòng)量等一般情況，共觀察24d。

1.7 腫瘤最大橫截面積測(cè)量 末次給藥24h后處死大鼠，斷頭取腦，以10%甲醛溶液固定后，取出腦膠質(zhì)瘤。以腫瘤中心為切入點(diǎn)作冠狀切面，測(cè)量每個(gè)切面腫瘤的最大橫截面積。

1.8 組織病理學(xué)觀察 取瘤組織制作石蠟切片、HE染色，觀察并比較各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)改變。

1.9 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用TUNEL法。石蠟切片，常規(guī)脫蠟，PBS沖洗；取50μl蛋白酶K消化，37℃下在濕盒中反應(yīng)30min，PBS沖洗；吸干水份，每片加30μl TUNEL反應(yīng)液，37℃在濕盒中反應(yīng)60min，PBS沖洗；每片加30μl堿性磷酸酶抗體進(jìn)行反應(yīng)，37℃在濕盒中反應(yīng)30min，PBS沖洗；吸干水份，每個(gè)載玻片上加一滴異硫氰酸熒光素，在室溫避光條件下孵育10min，PBS沖洗；予甘油和PBS封片，置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。然后用蘇木精重新染色，樹(shù)膠封片，置熒光顯微鏡下再次觀察。在40倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)瘤區(qū)視野，計(jì)算瘤細(xì)胞總數(shù)，400倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞）。凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后第2天基本恢復(fù)到術(shù)前水平，能自行進(jìn)食、飲水。造模后至第18天大鼠活動(dòng)較活躍，精神良好，能正常進(jìn)食、飲水，體重一直增加，無(wú)明顯顱內(nèi)高壓癥狀。第18～20天大鼠突然出現(xiàn)顱內(nèi)高壓癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、毛色晦暗、食欲不振、體重開(kāi)始下降、身體虛弱、活動(dòng)明顯減少等癥狀，甚至出現(xiàn)偏癱、全身抽搐，但無(wú)死亡。第22天空白對(duì)照組死亡1只；第23～24天空白對(duì)照組、單用冰片組各死亡1只。

2.2 各組大鼠腦膠質(zhì)瘤最大橫截面積比較 冰片聯(lián)合替莫唑胺組腦膠質(zhì)瘤最大橫截面積小于單用冰片組、單用替莫唑胺組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。單用替莫唑胺組腦膠質(zhì)瘤最大橫截面積小于單用冰片組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠腦膠質(zhì)瘤最大橫截面積比較（n=5）

2.3 各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)觀察結(jié)果 解剖大鼠可見(jiàn)右尾狀核區(qū)有團(tuán)塊狀腫瘤形成，呈圓形或橢圓形，向周圍腦組織浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，瘤體較大時(shí)可見(jiàn)中線向?qū)?cè)移位。HE染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組、單用冰片組呈典型的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞特征，細(xì)胞核呈高密度聚集，表示細(xì)胞增殖活躍；冰片聯(lián)合替莫唑胺組細(xì)胞核密度降低，表示細(xì)胞增殖受抑制；單用替莫唑胺組細(xì)胞核密度介于兩者之間，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。

圖1 造模第7天大鼠腦組織HE染色結(jié)果（×200）

圖2 各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織切片HE染色結(jié)果比較（a：冰片聯(lián)合替莫唑胺組；b：?jiǎn)斡锰婺虬方M；c：?jiǎn)斡帽M；d：空白對(duì)照組；×400；藍(lán)色表示細(xì)胞核）

圖3 各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織切片TUNEL染色結(jié)果比較（a：冰片聯(lián)合替莫唑胺組；b：?jiǎn)斡锰婺虬方M；c：?jiǎn)斡帽M；d：空白對(duì)照組；×400；藍(lán)色表示凋亡細(xì)胞）

2.4 各組大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率比較 TUNEL染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組與單用冰片組相近，基本看不到凋亡細(xì)胞；單用替莫唑胺組可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞；冰片聯(lián)合替莫唑胺組凋亡細(xì)胞明顯增多，見(jiàn)圖3（插頁(yè)）。冰片聯(lián)合替莫唑胺組細(xì)胞凋亡率高于單用替莫唑胺組、單用冰片組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；單用替莫唑胺組細(xì)胞凋亡率高于單用冰片組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率比較（n=5）

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，替莫唑胺是其主要化療藥物[4]，但血腦屏障的阻礙以及化療的不良反應(yīng)均會(huì)降低化療效果[5]。目前主要采取手術(shù)切除+放化療治療，但患者術(shù)后中位生存期僅為12～18個(gè)月[6]。因此，尋找一種治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的更有效藥物迫在眉睫。

血腦屏障是血漿與腦細(xì)胞之間的天然屏障，可阻礙外來(lái)物質(zhì)經(jīng)血液進(jìn)入腦組織，起到保護(hù)大腦的作用。但同時(shí)也會(huì)限制藥物的進(jìn)入，使其在腦組織中難以達(dá)到有效濃度，不利于腦部疾病的治療。因此，改變血腦屏障通透性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。冰片味辛、苦，微寒，歸心、脾、肺經(jīng)，具有抗炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)藥物吸收、芳香走竄、引藥上行的功效。研究表明，冰片是一種小分子脂溶性單帖類物質(zhì)，不僅自身能快速通過(guò)血腦屏障，還能增加血腦屏障通透性[7]。Wu等[8]一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冰片通過(guò)血腦屏障可能與細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)增加有關(guān)。研究表明，C6腦膠質(zhì)瘤模型的移植瘤株繁殖力和生存力均較強(qiáng)，相對(duì)其他模型更易建立，與人腦膠質(zhì)瘤的組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等特性相似，是目前研究腦腫瘤臨床療效的較好模型[9]。C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到Wistar大鼠顱內(nèi)后，腫瘤呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)且生長(zhǎng)較快，與正常腦組織的界線較不明顯，且有豐富的血管形成，與人腦膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)相似；此外，Wistar大鼠較SD大鼠更適合腦膠質(zhì)瘤相關(guān)研究[10]。

筆者所在團(tuán)隊(duì)既往建立Wistar大鼠的C6腦膠質(zhì)瘤模型進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冰片可通過(guò)提高血腦屏障通透性，從而增加對(duì)順鉑的攝入，使腦組織內(nèi)順鉑濃度升高，進(jìn)而提高對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的療效[11]。王南卜等[12]通過(guò)體外培養(yǎng)U251細(xì)胞并聯(lián)合冰片使用替莫唑胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)替莫唑胺抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用明顯增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。Han等[13]聯(lián)合使用冰片與ANGPEG-PAMAM聚合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冰片能增強(qiáng)血腦屏障的通透性，提高ANG-PEG-PAMAM聚合物體外抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用。亦有研究表明，冰片與Pep-1聯(lián)合使用能靶向IL-13受體過(guò)度表達(dá)的膠質(zhì)瘤，并穿透腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的生理障礙，增強(qiáng)藥物的穿透能力，與其他對(duì)照組比較，聯(lián)合冰片組的藥物在腦膠質(zhì)瘤中具有更強(qiáng)的熒光信號(hào)和更長(zhǎng)的保留時(shí)間[14]。

本研究通過(guò)建立Wistar大鼠的C6腦膠質(zhì)瘤模型，并聯(lián)合應(yīng)用冰片和替莫唑胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冰片聯(lián)合替莫唑胺組腫瘤最大橫截面積明顯小于其余各組，腫瘤細(xì)胞密度降低，增殖被明顯抑制，腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于其余各組；而單用替莫唑胺組可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞。因此，筆者認(rèn)為替莫唑胺不能高效地透過(guò)血腦屏障，而聯(lián)合應(yīng)用冰片對(duì)替莫唑胺抗大鼠膠質(zhì)瘤具有促進(jìn)作用。其作用機(jī)制可能與冰片開(kāi)放血腦屏障、促進(jìn)替莫唑胺通過(guò)、提高大鼠腦組織替莫唑胺濃度有關(guān)。但本研究局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，具體給藥方式和人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)等問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究。