干細(xì)胞因子抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡的研究

陳思瑩 饒杰 盧曄芬 陳建軍 程偉進(jìn) 鄭麗云

據(jù)統(tǒng)計(jì)，腦卒中年發(fā)病率高達(dá)1 287.3/10萬(wàn)，死亡率為126.4/10萬(wàn)，嚴(yán)重著威脅人們的健康[1]。在腦缺血、缺氧條件下，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞易發(fā)生損傷或壞死，再灌注損傷后往往導(dǎo)致腦缺血后二次損傷[2-3]。如何防治腦血管再灌注損傷是當(dāng)前腦卒中的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[4]。干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）與其酪氨酸激酶受體（c-Kit）構(gòu)成SCF/c-Kit通路，參與細(xì)胞活性功能調(diào)節(jié)，對(duì)缺血、缺氧組織具有保護(hù)作用[5]。然而，目前關(guān)于腦血管缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制尚未完全明確。本研究就SCF對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）抑制劑Compound C（S7306）、激活劑阿卡地新（AICAR）（S1802）購(gòu)自美國(guó)塞萊克公司，SCF（S7901-10UG，≥97.0%）、噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒及凋亡試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）、斷裂半胱氨酸蛋白酶-12（cleaved Caspase-12）、Bcl-2相關(guān) X 蛋白（Bax）、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞信號(hào)技術(shù)（CST）公司。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（h-BMEC）購(gòu)自美國(guó)Scien Cell研究實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將h-BMEC置于含10%FBS的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM，100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，在 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 分組與建模 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將h-BMEC分為對(duì)照組、糖氧剝奪（OGD）組、SCF+OGD組（簡(jiǎn)稱SCF組）、SCF+Compound C+OGD組（簡(jiǎn)稱Comp C組）和SCF+AICAR+OGD組（簡(jiǎn)稱AICAR組）。依據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法，建立細(xì)胞糖氧剝奪模型。待細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí)，用PBS洗滌1次，加入無(wú)糖培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)器皿置入OGD培養(yǎng)裝置中，向內(nèi)沖入混合氣體（95%N2+5%CO2），持續(xù)6h；更換含20%FBS的高糖培養(yǎng)基。SCF組、Comp C 組、AICAR組分別予 300μmol/ml SCF、1μmol/L Compound C、1mmol/L AICAR處理OGD細(xì)胞；對(duì)照組在常規(guī)條件下置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將各組置入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT法。調(diào)整h-BMEC密度為2×104個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合達(dá)80%左右時(shí)，按上述分組方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置調(diào)零孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。24h后，加入20μl MTT，37℃恒溫箱孵育1～2h，棄培養(yǎng)基，加入二甲亞砜；以調(diào)零孔光密度值調(diào)零校準(zhǔn)，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量檢測(cè) 分別采用水溶性四唑鹽-8（WST-8）、硫代巴比妥酸（TBA）法進(jìn)行檢測(cè)。調(diào)整h-BMEC密度為2×105個(gè)/ml，接種于6孔板中，按上述分組方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照SOD活性檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。上機(jī)檢測(cè)，使用酶標(biāo)儀分析細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/PI）雙染法。0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，使用500μl上樣緩沖液重懸，依次加入 5μl Annexin V、5μl PI，室溫下避光孵育 15min，上機(jī)檢測(cè)，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。調(diào)整h-BMEC密度為2×105個(gè)/ml，接種于6孔板中，按上述分組方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。24h后，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）細(xì)胞裂解液冰上裂解15min，12 000r/min離心15min，吸取上清液，收集總蛋白。采用二喹啉甲酸(（BCA）法定量后，取20μg總蛋白用6%～10%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，10%脫脂牛奶封閉10min。加入適當(dāng)稀釋度的一抗（AMPK、p-AMPK、PERK、CHOP、Caspase-12、Bax、Bcl-2、β-actin），4℃孵育，過(guò)夜；磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗體，在室溫下孵育1～2h，PBST洗滌；經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光、顯影和定影后，使用Image J軟件分析條帶的灰度值，即相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組h-BMEC細(xì)胞存活率比較 OGD組、SCF組、Comp C組、AICAR組、對(duì)照組細(xì)胞存活率分別為（51.26±9.37）%、（88.23±6.68）%、（93.61±7.40）%、（55.11±8.65）%、（97.15±4.18）%。與對(duì)照組比較，OGD組、AICAR組細(xì)胞存活率均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與OGD組比較，SCF組、Comp C組細(xì)胞存活率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Comp C組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組h-BMEC細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量比較 與對(duì)照組比較，OGD組、AICAR組SOD活性均降低，MDA含量均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；SCF組、Comp C組SOD活性均增高，MDA含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組SOD活性降低，MDA含量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組h-BMEC細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量比較

2.3 各組h-BMEC細(xì)胞凋亡率及Bax、Bcl-2表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，OGD組、AICAR組Bcl-2表達(dá)均降低，細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)、Bax/Bcl-2均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與OGD組比較，SCF組、Comp C組Bcl-2表達(dá)均增高，細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)、Bax/Bcl-2均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組Bcl-2表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)、Bax/Bcl-2均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2和圖1。

表2 h-BMEC細(xì)胞凋亡率及Bax、Bcl-2表達(dá)比較

圖1 各組h-BMEC的Bax、Bcl-2表達(dá)的電泳圖

2.4 各組h-BMEC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，OGD組、AICAR組PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表達(dá)均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與OGD組比較，SCF組、Comp C組PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組PERK、CHOP、cleaved Caspase-12表達(dá)均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3和圖2。

表3 各組h-BMEC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖2 各組h-BMEC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

2.5 各組h-BMEC的p-AMPK、AMPK表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，OGD組、AICAR組p-AMPK表達(dá)均增高，SCF組、Comp C組均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與OGD組比較，SCF組、Comp C組p-AMPK表達(dá)均降低，AICAR組增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與SCF組比較，AICAR組p-AMPK表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4和圖3。

表4 各組h-BMEC的p-AMPK、AMPK表達(dá)比較

圖3 各組h-BMEC的p-AMPK、AMPK表達(dá)的電泳圖

3 討論

SCF與其c-Kit廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與腦組織的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)。SCF/c-Kit通過(guò)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的保護(hù)作用。Dhandapani等[7]發(fā)現(xiàn)SCF可抑制谷氨酸神經(jīng)毒性反應(yīng)。Sun等[8]證實(shí)SCF可促進(jìn)腦損傷局域神經(jīng)修復(fù)。羅云等[9]證實(shí)缺血性損傷可增加SCF表達(dá)，降低腦細(xì)胞損害，提示SCF/c-Kit通路與缺血性損傷修復(fù)密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與OGD組比較，SCF組細(xì)胞存活率明顯增高，細(xì)胞凋亡率明顯下降，Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增高，Bax/Bcl-2下降，而SOD活性增高，MDA含量降低；這說(shuō)明SCF具有抑制OGD誘導(dǎo)h-BMEC損傷作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，OGD細(xì)胞內(nèi)CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表達(dá)明顯增高；這說(shuō)明在OGD條件下，細(xì)胞啟動(dòng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡。與OGD組比較，SCF 組 CHOP、PERK、cleaved Caspase-12 表達(dá)明顯降低，這說(shuō)明SCF具有抑制OGD誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡是指在應(yīng)激狀態(tài)持續(xù)或強(qiáng)化條件下，通過(guò)級(jí)聯(lián)活化凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞凋亡，其中CHOP是最經(jīng)典的凋亡通路。CHOP接受PERK、質(zhì)網(wǎng)核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 a1（IRE1）、活化轉(zhuǎn)錄因子 6（ATF6）、活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）等分子激活后，轉(zhuǎn)而促進(jìn)Caspase-12活化或Bcl-2降解，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。有學(xué)者報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡途徑受AMPK通路調(diào)控[10-11]。Yang等[10]證實(shí)，鉬通過(guò)激活A(yù)MPK依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能紊亂和凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD組細(xì)胞內(nèi)p-AMPK表達(dá)明顯增高，而SCF組較OGD組明顯降低；這說(shuō)明SCF對(duì)AMPK的活化具有明顯抑制作用。與SCF組比較，AICAR組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，凋亡比例明顯增高，Bax表達(dá)增高，Bcl-2表達(dá)降低，Bax/Bcl-2增高，SOD活性降低，MDA含量增高，CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表達(dá)明顯降低；Comp C組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率以及 CHOP、PERK、cleaved Caspase-12表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明OGD細(xì)胞中AMPK被活化，且AMPK介導(dǎo)SCF抵抗OGD誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，SCF對(duì)OGD誘導(dǎo)的h-BMEC損傷具有抑制作用，其分子機(jī)制與抑制AMPK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡有關(guān)。