白芍總苷抑制局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元損傷的機(jī)制研究

李紅霞 張益明 陳剛 徐立 陳小麗 代小蘭

海馬神經(jīng)元與機(jī)體多種神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)，尤其是空間學(xué)習(xí)記憶能力[1-2]。因此，抑制海馬神經(jīng)元損傷對(duì)改善缺血性腦損傷患者的臨床癥狀具有至關(guān)重要的作用。白芍總苷為毛茛科白芍屬植物白芍的活性成分，既往研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能夠改善大鼠認(rèn)知功能障礙并調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)因子[3]。本研究就白芍總苷對(duì)局灶性腦缺血損傷大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量230～260g，購(gòu)自寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（浙）2014-0005]，動(dòng)物批次號(hào)：20181030006。實(shí)驗(yàn)前清潔環(huán)境飼養(yǎng)1周，每天光照12h+黑暗12h，恒室溫25℃，相對(duì)濕度50%～70%，自由飲水、進(jìn)食。

1.2 主要試劑 白芍總苷膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字H20055058，0.3g/粒，批號(hào)201712005，寧波立華制藥有限公司）；NF-κB、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bax）多克隆抗體和二喹琳甲酸法（BCA）測(cè)定試劑盒（批號(hào) 201710013、201801007、201712011、201803002，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒及TUNEL 試劑盒（批號(hào) 20180116、20180305、20180324、20171109，南京建成生物工程研究所）；IL-1β、IL-6、TNF-α 的 ELISA 試劑盒（批號(hào) 180117、171230、171125，北京華英生物技術(shù)研究所）。

1.3 主要儀器 Multiskan MK-3型酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司）；SZ-1型組織勻漿器（江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；DU700型紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；H-7650型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；RM2125型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BH-2型倒置光學(xué)顯微鏡及攝像（日本Olympus公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型建立 參照王新鳳等[4]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法，建立局灶性腦缺血大鼠模型。（1）線栓制作：取直徑0.235mm釣魚線并剪制3.5cm長(zhǎng)度分段，輕輕灼燒一側(cè)呈釘子帽狀，在距離“釘子帽”一側(cè)18～20mm處作標(biāo)記，備用。（2）模型制備：大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，頸部正中作切口，剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈（充分暴露3者分叉處），結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉處近心端作一切口，插入線栓至頸內(nèi)動(dòng)脈，遇阻力停止，深度距分叉處約18mm，固定線栓后逐層縫合，消毒。假手術(shù)組大鼠除不插入線栓外，其余操作同模型組。

1.4.2 分組與給藥 將造模成功的100只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、白芍總苷高劑量組（200mg/kg）、中劑量組（100mg/kg）、低劑量組（50mg/kg），每組 25只；假手術(shù)組大鼠25只。術(shù)后第2天開始灌胃給藥，白芍總苷高、中、低劑量組分別將相應(yīng)劑量的白芍總苷溶于3ml的0.9%氯化鈉溶液中，假手術(shù)組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液；1次/d，共28d。

1.4.3 海馬神經(jīng)元病理學(xué)觀察 每組大鼠隨機(jī)取10只，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后開胸、暴露心臟，于左心室植入一灌注針頭、右心耳作一切口，快速灌洗0.9%氯化鈉溶液，直至右心耳切口處流出的液體清澈停止；再用4%多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注固定，灌注速度由快變慢，待大鼠完全僵硬后，斷頭取腦分離出海馬組織，置4%多聚甲醛溶液固定24h，石蠟包埋、切片（厚2μm），二甲苯透明、梯度乙醇脫蠟、水化處理，再行HE染色。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并照相保存。

1.4.4 海馬神經(jīng)元凋亡情況觀察 取上述制備的海馬組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化處理后，進(jìn)行TUNEL法染色。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并照相，細(xì)胞核棕黃色為陽(yáng)性著色。每只大鼠隨機(jī)取5張染色切片，每張切片取5個(gè)互不重疊的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)（AI）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.4.5 超微結(jié)構(gòu)觀察 取各組5只大鼠，按上述方法心臟灌流固定至肝臟顏色明顯變淡時(shí)，立即斷頭取腦并分離出海馬組織，切割成約1mm3小塊后置4℃預(yù)冷的3%戊二醛溶液中，于4℃冰箱內(nèi)固定2h；PBS浸洗30min，置1%四氧化鋨溶液中，于4℃冰箱內(nèi)再固定2h；依次經(jīng)梯度乙醇脫水、還氧丙烷置換、環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合、光學(xué)顯微鏡下定位，超薄切片（60nm）經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在10 000倍透射電子顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4.6 凋亡相關(guān)蛋白（NF-κB、Bcl-2、Bax）表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。（1）蛋白提取：取各組剩余10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，迅速置PBS凍結(jié)的冰塊上取腦并分離出海馬組織，置離心管中加入9倍量放射免疫沉淀法蛋白裂解液，將離心管置于盛有冰水混合物的燒杯中，研磨勻漿，低溫高速離心（4℃，12 000rpm）15min后取上清液，-70℃冰箱保存，備檢。（2）總蛋白含量測(cè)定：嚴(yán)格按照BCA測(cè)定試劑盒說明進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處吸光度值，根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總蛋白濃度。（3）Western blot檢測(cè)：蛋白樣本經(jīng)沸水10min高溫變性處理后，上樣、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳（電壓130V，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部時(shí)停止）、轉(zhuǎn)PVDF膜（電壓100V、2h），麗春紅溶液染膜、洗膜，5%脫脂奶粉封閉 1h，滴加一抗[NF-κB、Bcl-2、Bax、β-actin（1:500）]，4℃搖床過夜；洗膜后滴加二抗（1:100），室溫?fù)u床孵育1h；洗膜后滴加電化學(xué)發(fā)光底物，室溫孵育1min。利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片上相應(yīng)條帶進(jìn)行掃描，通過條帶灰度值計(jì)算蛋白含量。

1.4.7 抗氧化酶（SOD、CAT）活性及MDA含量檢測(cè) 取上述海馬組織勻漿液，嚴(yán)格按照各試劑盒說明進(jìn)行操作。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，生化分析法測(cè)定CAT活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。

1.4.8 炎癥細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平檢測(cè) 取上述海馬組織勻漿液，嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白芍總苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)改變的影響 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整清晰、排列整齊、層次清晰（呈3～5層），未見異常；模型組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、間隙增大、層次不清，細(xì)胞邊界不清、胞體腫脹變大、核固縮偏移等，呈明顯病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；白芍總苷低、中、高劑量組海馬神經(jīng)元上述病理性改變較模型組不同程度減輕，高劑量組最明顯：神經(jīng)元排列較為整齊、細(xì)胞分界清晰，可見少量神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，見圖1（插頁(yè)）。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)檢查結(jié)果（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；e：高劑量組；HE染色，×200）

2.2 白芍總苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯多于假手術(shù)組，白芍總苷低、中、高劑量組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量較模型組不同程度減少，見圖2（插頁(yè)）。模型組AI為（58.76±9.48）%，明顯高于假手術(shù)組的（2.37±0.98）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；白芍總苷中、高劑量組AI分別為（31.84±7.09）%、（25.47±6.28）%，均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；白芍總苷低劑量組AI為（49.93±10.27）%，與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；e：高劑量組；TUNEL法，×200）

2.3 白芍總苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)未見異常。模型組海馬神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的病理性超微結(jié)構(gòu)改變，包括胞膜破裂、碎片；胞漿溶解呈空泡狀；核膜破裂、核仁邊界不清、周圍間隙增大；線粒體數(shù)量減少、體積增大、嵴斷裂溶解、嵴內(nèi)間隙增大；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒脫落；高爾基體腫脹變大等。白芍總苷低、中、高劑量組上述病理性超微結(jié)構(gòu)改變較模型組呈不同程度減輕，其中高劑量組最顯著，見圖3（插頁(yè)）。

圖3 各組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；e：高劑量組；透射電子顯微鏡，×10 000）

2.4 白芍總苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax的影響 模型組大鼠海馬 Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白較假手術(shù)組均明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；白芍總苷中、高劑量組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax、NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1和圖4。

表1 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比較

圖4 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白表達(dá)的電泳圖（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；e：高劑量組）

2.5 白芍總苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬SOD、CAT活性和MDA含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬SOD、CAT活性均明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組大鼠海馬SOD、CAT活性均明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

2.6 白芍總苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表2 各組大鼠海馬SOD、CAT活性及MDA含量比較

表3 各組大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（nmol/L）

3 討論

腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病，其中缺血性腦血管病占70%以上，具有高致殘率和高致死率，嚴(yán)重危害著人類生命與建康[5-6]。海馬是與認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的腦區(qū)，而海馬神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧最為敏感[7-8]，因此保護(hù)海馬神經(jīng)元對(duì)減少認(rèn)知障礙等并發(fā)癥具有重要作用。

白芍總苷是我國(guó)傳統(tǒng)中藥白芍的主要活性成分，具有多種藥理學(xué)活性。本研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能明顯改善局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元層次不清、排列紊亂、神經(jīng)元數(shù)量減少、間隙增大、胞體腫脹變大、核固縮偏移等病理性改變；抑制神經(jīng)元凋亡；抑制神經(jīng)元細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器等出現(xiàn)的超微結(jié)構(gòu)病變。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多種機(jī)制參與腦缺血所致海馬神經(jīng)元損傷病理過程，其中氧化應(yīng)激[9-10]、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11-12]、細(xì)胞凋亡[11]具有重要的作用。腦缺血后氧自由基大量生成、抗氧化酶（SOD、CAT）失活及過度消耗是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的根本原因，氧自由基能氧化不飽和脂肪酸并破壞細(xì)胞膜，還能損傷核酸、引發(fā)DNA斷裂等；脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物為MDA，其含量與氧自由基數(shù)量呈正相關(guān)，是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激損傷程度的敏感指標(biāo)[13]。白芍總苷是一種天然抗氧化劑，具有良好的抗氧化作用[14]，本研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能明顯提高局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)海馬SOD、CAT活性并降低MDA含量；提示白芍總苷能恢復(fù)缺血側(cè)海馬已耗盡的抗氧化能力，從而抑制其氧化應(yīng)激反應(yīng)。

腦缺血能病理性刺激小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而過度釋放炎癥因子（如細(xì)胞因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等），進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，使缺血區(qū)腦組織炎癥細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集[15]；中性粒細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子而進(jìn)一步活化膠質(zhì)細(xì)胞[16]，從而形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)炎癥細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)上調(diào)，而IL-1β水平升高可刺激另一種炎癥細(xì)胞因子IL-6表達(dá)上調(diào)[17]，IL-6水平與腦梗死體積密切相關(guān)。因此，IL-6可作為腦組織損傷的評(píng)價(jià)指標(biāo)[18]。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，腦缺血早期即可檢測(cè)到TNF-α表達(dá)上調(diào)。有研究證實(shí)，通過阻斷TNF-α表達(dá)能降低DNA碎片、減輕缺血側(cè)腦損傷[19]。李振彬等[20]研究證實(shí)，白芍總苷具有炎癥抑制作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能明顯降低局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平，提示白芍總苷具有抑制缺血側(cè)海馬炎癥反應(yīng)的作用。

腦缺血發(fā)生后，缺血核心區(qū)神經(jīng)元在數(shù)小時(shí)甚至幾分鐘內(nèi)即發(fā)生不可逆壞死，而缺血核心區(qū)與正常腦組織之間的“半暗帶”神經(jīng)元死亡以凋亡為主要表現(xiàn)。細(xì)胞凋亡機(jī)制非常復(fù)雜，多種蛋白或活化蛋白酶參與凋亡過程的調(diào)控。Bcl-2蛋白家族通過影響線粒體膜通透性而在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[21]，其中抗凋亡蛋白Bcl-2能將凋亡激活因子（Apaf-1）固定在線粒體膜上，從而抑制其發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用。Bcl-2能通過抑制谷胱甘肽外泄而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位，從而控制膜電位、抑制細(xì)胞凋亡；此外，促凋亡蛋白Bax為小分子細(xì)胞色素C提供通道，由線粒體進(jìn)入胞質(zhì)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2蛋白能與Bax蛋白形成同源二聚體，抑制Bax活性，關(guān)閉Bax通道而阻止小分子通過，從而拮抗Bax促凋亡作用。因此Bcl-2/Bax可反映兩者在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用[22]。氧自由基是NF-κB蛋白的重要激活劑[23]，活化NF-κB蛋白能進(jìn)入細(xì)胞核，并與凋亡相關(guān)基因cmyc結(jié)合，從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。齊晅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，活化NF-κB蛋白在炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡之間具有重要的橋梁作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能明顯上調(diào)局灶性腦缺血大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào) Bax、NF-κB蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax，這可能是白芍總苷抑制缺血側(cè)海馬神經(jīng)元凋亡的重要分子機(jī)制。

綜上所述，白芍總苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元病理性改變及超微結(jié)構(gòu)病變具有保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與其調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、抑制氧化應(yīng)激和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。