尿IL-18、轉(zhuǎn)鐵蛋白和β2微球蛋白在新生兒窒息致急性腎損傷早期診斷中的價(jià)值

張麗亞 陳黎麗 羅芳

新生兒窒息可致多臟器功能損傷甚至衰竭，是我國(guó)新生兒死亡和致殘的重要因素之一[1]。新生兒窒息常導(dǎo)致急性腎損傷（AKI），并可發(fā)展成急性腎功能衰竭[2]。目前臨床上主要采用血清肌酐（Scr）、尿量等指標(biāo)進(jìn)行診斷，但其靈敏度較差，加上新生兒腎功能的影響因素較為復(fù)雜，當(dāng)Scr發(fā)生明顯變化時(shí)，患兒腎功能損害已非常明顯，往往失去了早期干預(yù)的機(jī)會(huì)；同時(shí)反復(fù)抽血檢測(cè)也會(huì)對(duì)患兒造成傷害。相對(duì)于血液，尿液更容易獲取且無(wú)創(chuàng)傷。Scr僅反映腎小球?yàn)V過(guò)功能，但腎濾過(guò)功能具有強(qiáng)大的代償能力，當(dāng)功能損傷超過(guò)50%時(shí)Scr才開(kāi)始升高。然而，尿液指標(biāo)能更全面反映腎臟功能，如尿微量白蛋白、β2微球蛋白（β2-MG）等。此外，腎損傷時(shí)也會(huì)分泌一些物質(zhì)并隨尿排出體外，這些物質(zhì)在尿液中的濃度可反映腎損傷的程度。研究表明，與尿微量白蛋白比較，尿轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）反映腎小球?yàn)V過(guò)膜的屏障功能受損更靈敏[3]。IL-18是主要由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的前炎癥因子，具有免疫誘導(dǎo)功能，當(dāng)腎損傷時(shí)會(huì)分泌IL-18并隨尿液排出，可反映腎損傷的程度。本研究通過(guò)檢測(cè)尿IL-18、TRF和β2-MG等指標(biāo)，探討這些指標(biāo)對(duì)新生兒窒息致AKI早期診斷的價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年7月至2018年10月在本院出生的發(fā)生窒息合并AKI足月新生兒50例、發(fā)生窒息未診斷AKI足月新生兒50例、同期健康的足月新生兒50例（正常對(duì)照組）為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：38周≤胎齡＜42周；2.5kg≤出生體重＜4.0kg。排除患有泌尿系統(tǒng)先天畸形、圍生期感染等非窒息因素導(dǎo)致影響腎功能的疾病者。AKI的診斷與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考2012國(guó)際改善全球腎臟疾病預(yù)后組織關(guān)于AKI的指南：48h內(nèi)Scr≥26.5μmoL/L，已知或推測(cè)過(guò)去7d內(nèi)Scr≥基線值1.5倍，或持續(xù)6h尿量＜0.5ml/（kg·h）為急性AKI，具體見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集并比較3組對(duì)象的一般資料，包括性別、胎齡、體重、出生后Apgar評(píng)分（8～10分為正常，0～7分為窒息）、48h Scr變化值、48h尿量等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) （1）尿IL-18、TRF、β2-MG檢測(cè)：分別留取新生兒出生后 0～6h、6～12h、12～24h、24～48h 等 4個(gè)時(shí)段的新鮮尿液2ml，1500r/min離心5min，存于-80℃冰箱內(nèi)備用。Human IL-18 Platinum ELISA試劑盒（ARG80138）由美國(guó) eBioscience公司提供，在 Wallac Victor 1420型酶標(biāo)儀460nm讀取結(jié)果；尿β2-MG檢測(cè)試劑（20180327）由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供，使用中國(guó)Autolumo A2000Plus全自動(dòng)生化分析儀以磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)；尿TRF檢測(cè)試劑（M808234）由貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司提供，使用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司提供的IMMAGE 800免疫分析儀以免疫透射比濁法進(jìn)行檢測(cè)。（2）Scr檢測(cè)：對(duì)于新生兒窒息者，盡早抽取靜脈血2ml，4 000r/min離心5min，檢測(cè) Scr；抽血 48h 后再取靜脈血 2ml，檢測(cè) Scr。Scr檢測(cè)試劑（20180402）由寧波美康生物科技有限公司提供，使用美國(guó)貝克曼AU680型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)不同時(shí)段比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。不同時(shí)間段尿IL-18、β2-MG、TRF對(duì)新生兒窒息致AKI的診斷效能評(píng)價(jià)采用ROC曲線分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 AKI診斷與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 3組對(duì)象一般資料比較 3組對(duì)象性別、胎齡、體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；Apgar評(píng)分、48h Scr變化值、48h尿量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表 2。

表2 3組對(duì)象一般資料比較

2.2 3組對(duì)象不同時(shí)段尿IL-18、β2-MG、TRF比較 除出生后0～6h尿TRF外，其余不同時(shí)段尿IL-18、β2-MG、TRF3組對(duì)象比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。窒息合并AKI組4個(gè)時(shí)段尿IL-18、β2-MG、TRF比較，以及窒息未診斷AKI組4個(gè)時(shí)段尿β2-MG、TRF比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；正常對(duì)照組4個(gè)時(shí)段尿IL-18、β2-MG、TRF比較，以及窒息未診斷AKI組4個(gè)時(shí)段尿IL-18比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 3。

表3 3組對(duì)象不同時(shí)段尿IL-18、β2-MG、TRF比較

2.3 窒息合并不同AKI分級(jí)患兒不同時(shí)段尿IL-18、β2-MG、TRF比較 依據(jù)2012國(guó)際改善全球腎臟疾病預(yù)后組織關(guān)于AKI的指南，AKIⅠ級(jí)23例，Ⅱ級(jí)19例，Ⅲ級(jí)8例。隨著AKI分級(jí)增高，各時(shí)段尿IL-18、β2-MG及TRF不斷增高；隨著尿標(biāo)本留取時(shí)間的延長(zhǎng)，AKI患者尿IL-18、β2-MG及TRF不斷增高，見(jiàn)表4。

2.4 不同時(shí)間段尿IL-18、β2-MG、TRF對(duì)新生兒窒息致AKI的診斷效能 0～6h尿IL-18的診斷效能最高，AUC為0.65；6～12h尿β2-MG的診斷效能最高，AUC為0.85；12～24h尿 β2-MG、TRF 的診斷效能最高，AUC 均為 0.96；24～48h 尿 β2-MG、TRF 的診斷效能最高，AUC均為1.00。3者聯(lián)合診斷效能均優(yōu)于單項(xiàng)指標(biāo)，0～6h、6～12h、12～24h、24～48h 的 AUC 分別為 0.77、0.96、1.00、1.00，見(jiàn)圖 1。

3 討論

新生兒窒息后并發(fā)癥往往累及多器官，主要包括心、腦、腎等[4]。新生兒窒息后，機(jī)體血液通過(guò)潛水反射重新分布并優(yōu)先保證心、腦、腎上腺等重要臟器的血供，而通往腎臟組織的血流迅速減少，易造成腎損傷。據(jù)報(bào)道，我國(guó)新生兒窒息發(fā)生率約為5%[5]；而窒息又是腎損傷的第一病因[6]。對(duì)于腎損傷，早期診斷與干預(yù)是降低腎損傷病死率的關(guān)鍵。但不少患兒雖出現(xiàn)不同程度的急性腎功能異常，但未達(dá)到腎衰竭的標(biāo)準(zhǔn)，可能失去早診斷早干預(yù)的時(shí)機(jī)，最終可發(fā)展為終末期腎病。近年來(lái)，國(guó)際上用AKI的標(biāo)準(zhǔn)取代傳統(tǒng)的急性腎功能衰竭，為腎臟早期損傷的診斷提供依據(jù)。AKI表現(xiàn)為突然或連續(xù)性的腎功能衰退，涵蓋了從腎功能微小改變到腎功能衰竭的整個(gè)過(guò)程。據(jù)報(bào)道，新生兒窒息致急性腎功能衰竭的比例接近10%，而AKI的比例超過(guò)60%[7-8]。

表4 窒息合并不同AKI分級(jí)患兒不同時(shí)段尿IL-18、β2-MG、TRF比較

圖 1 不同時(shí)間段尿 IL-18、β2-MG、TRF 診斷新生兒窒息致 AKI的 ROC 曲線（a：0～6h，AUCIL-18=0.65，AUCβ2-MG=0.62，AUCTRF=0.57，AUC聯(lián)合 =0.77；b：6～12h，AUCIL-18=0.79，AUCβ2-MG=0.85，AUCTRF=0.76，AUC 聯(lián)合 =0.96；c：12～24h，AUCIL-18=0.89，AUCβ2-MG=0.96，AUCTRF=0.96，AUC聯(lián)合 =1.00；d：24～48h，AUCIL-18=0.96，AUCβ2-MG=1.00，AUCTRF=1.00，AUC 聯(lián)合 =1.00）

2001年Bellomo等[9]首次提出了AKI。2002年急性透析質(zhì)量專家組提出了AKI的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]，并將其分為風(fēng)險(xiǎn)期（R）、損傷期（I）、衰竭期（F）、失功能期（L）和終末腎病期（E），簡(jiǎn)稱RIFLE分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。由于其分級(jí)診斷主要依據(jù)Scr較基線值升高倍數(shù)和eGFR確定，而Scr與GFR變化并不完全一致；加上很多患者并無(wú)基礎(chǔ)腎功能指標(biāo)監(jiān)測(cè)值，依據(jù)Scr較基線值升高倍數(shù)進(jìn)行診斷與分級(jí)存在問(wèn)題。為提高診斷的靈敏度，2005年AKI工作網(wǎng)絡(luò)（AKIN）對(duì)RIFLE分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行簡(jiǎn)化，即AKIN診斷標(biāo)準(zhǔn)。RIFLE標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)與以往狀態(tài)的比較以及腎功能變化的累積效應(yīng)，而AKIN標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)短期內(nèi)上升幅度及腎功能變化速度[11]。2012年國(guó)際改善全球腎臟病預(yù)后組織在RIFLE和AKIN標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上對(duì)AKI標(biāo)準(zhǔn)再次進(jìn)行修訂并發(fā)表了AKI指南，明確了急性AKI的診斷標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)患者Scr和尿量符合不同分級(jí)時(shí)，選擇最高分級(jí)。但該標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)腎功能的主要指標(biāo)是Scr和尿量，由于新生兒Scr和尿量受多種因素影響，不同個(gè)體新生兒的尿量差異很大，加上新生兒Scr的正常參考值尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，基線值難以確定；因此，目前該診斷標(biāo)準(zhǔn)用于新生兒AKI的評(píng)價(jià)受到限制。

目前Scr檢測(cè)僅能反映腎小球?yàn)V過(guò)功能受損程度，而腎小球?yàn)V過(guò)功能具有強(qiáng)大的代償能力，只有當(dāng)濾過(guò)功能損傷超過(guò)50%時(shí)Scr才升高。因此，可認(rèn)為在發(fā)生窒息而未達(dá)到AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)的患兒中，有相當(dāng)一部分患兒實(shí)際上已發(fā)生腎損傷。腎臟功能包括腎小球?yàn)V過(guò)功能和膜屏障功能，以及腎小管的重吸收、尿液濃縮及酸堿調(diào)節(jié)功能等。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，腎小管功能在反映腎損傷時(shí)較腎小球更為靈敏[12-13]。另外，當(dāng)腎損傷時(shí)會(huì)分泌一些物質(zhì)并隨尿液排出體外，因此本研究以反映腎小球?yàn)V過(guò)膜屏障功能受損的TRF、反映腎小管重吸收功能的β2-MG以及腎損傷時(shí)分泌的IL-18作為觀察指標(biāo)，探討其在新生兒窒息致腎損傷早期診斷中的價(jià)值。TRF為單鏈糖蛋白，在肝臟內(nèi)合成，生物半衰期7～10d，分子質(zhì)量與白蛋白接近，多項(xiàng)研究表明其可作為反映腎小球膜屏障功能的標(biāo)志物[14-15]。此外，TRF所帶負(fù)電荷較微量白蛋白少，更易通過(guò)帶負(fù)電荷的腎小球?yàn)V過(guò)膜，在檢測(cè)早期腎小球損傷方面較微量白蛋白更靈敏。尿β2-MG是細(xì)胞表面人白細(xì)胞抗原的β鏈（輕鏈）部分，分子質(zhì)量11 800，由99個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽。它可從腎小球自由濾過(guò)，99.9%在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細(xì)胞中分解破壞，故在正常情況下尿β2-MG濃度很低。當(dāng)腎小管受損時(shí)，尿β2-MG明顯增高，是反映腎小管重吸收功能的理想指標(biāo)[16]。IL-18是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌的前炎癥細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)包括IFN-γ在內(nèi)的多種細(xì)胞因子，還可通過(guò)細(xì)胞凋亡蛋白酶-1（Caspase-1）的激活參與炎癥及免疫反應(yīng)，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，參與多臟器局部缺血性損傷等過(guò)程[17]。Caspase-1和IL-18主要表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞中，當(dāng)腎臟受到血流灌注下降等急性損傷時(shí)，Caspase-1激活I(lǐng)L-18前體并裂解為有活性的IL-18，對(duì)腎臟起保護(hù)作用，同時(shí)增高的IL-18隨尿排出。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，尿IL-18指標(biāo)對(duì)多種因素引起的AKI具有良好的診斷與預(yù)后評(píng)估價(jià)值，且尿IL-18增高遠(yuǎn)早于Scr的增高[18-21]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，窒息未診斷AKI組各時(shí)間段尿TRF、β2-MG和IL-18均有不同程度的升高，說(shuō)明在窒息未診斷AKI患兒中有腎損傷發(fā)生。在窒息合并AKI組中，48h內(nèi)尿TRF、β2-MG和IL-18均隨尿標(biāo)本留取時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。在窒息未診斷AKI組中，3項(xiàng)指標(biāo)在6～12h尿液中濃度均高于0～6h，之后除IL-18下降不明顯外，TRF、β2-MG均有不同程度的下降；提示在窒息未診斷AKI患者0～6h尿液中，3項(xiàng)指標(biāo)均會(huì)出現(xiàn)明顯升高過(guò)程，隨后回落。在窒息未診斷AKI組、窒息合并AKI組中，0～6h尿IL-18、β2-MG均有所增高。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，0～6h尿IL-18在區(qū)分窒息未診斷AKI與窒息合并AKI的診斷效能最佳；分析原因可能是IL-18為前炎癥細(xì)胞因子，在腎臟組織細(xì)胞發(fā)生凋亡以及腎臟功能受損前就已升高。窒息未診斷AKI組與窒息合并AKI組6～12h尿TRF開(kāi)始升高，提示可能在窒息引起的AKI中，腎小球的膜屏障功能受損出現(xiàn)的時(shí)間相對(duì)較晚；此外，該時(shí)段尿β2-MG的診斷效能優(yōu)于 IL-18。12～24h、24～48h 尿 TRF、β2-MG 診斷效能均優(yōu)于IL-18；原因可能是在窒息未診斷AKI患兒尿IL-18保持較高水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，3者聯(lián)合診斷效能明顯高于單一指標(biāo)；12～24h尿液指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果就能將窒息未診斷AKI與窒息合并AKI患兒完全區(qū)分，明顯縮短了AKI的診斷時(shí)間。此外，對(duì)不同AKI分級(jí)患兒尿TRF、β2-MG和IL-18分析發(fā)現(xiàn)，3項(xiàng)指標(biāo)濃度隨分級(jí)增高而增高，提示具有反映病情進(jìn)展的作用。

綜上所述，尿IL-18、β2-MG和TRF在新生兒窒息致AKI早期診斷中具有一定的臨床價(jià)值，0～6h尿IL-18診斷效能最高，之后其診斷效率低于TRF和β2-MG，3者聯(lián)合診斷效能優(yōu)于單項(xiàng)指標(biāo)，可明顯縮短診斷時(shí)間，同時(shí)采取尿液作為檢測(cè)標(biāo)本可減少對(duì)患兒的傷害。但是，嚴(yán)重腎損傷患兒可出現(xiàn)持續(xù)無(wú)尿；另外由于新生兒處于特殊代謝時(shí)期，各指標(biāo)的個(gè)體差異較大，對(duì)最終結(jié)果可能造成影響，在一定程度上具有局限性。