線粒體融合蛋白2在姜黃素減輕膿毒癥小鼠淋巴細(xì)胞凋亡中的作用

支紹冊(cè) 鄭來(lái)贊 洪廣亮 陳隆望 李海嘯 倪菁晶 李萌芳 趙光舉 盧中秋

膿毒癥是宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致器官功能障礙的疾病狀態(tài)，已成為全球日益嚴(yán)重的健康問(wèn)題[1-2]。盡管早期液體復(fù)蘇、新型抗生素和器官功能支持等治療措施使治療效果有了重大進(jìn)步，但膿毒癥的死亡率仍然居高不下，達(dá)30%～50%[3-4]。姜黃素是姜黃的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗誘變等作用，并且對(duì)免疫系統(tǒng)有著重要調(diào)節(jié)作用，可降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的病死率[5-8]。線粒體融合蛋白 2（mitofusin2，Mfn2）位于線粒體外膜中，在線粒體融合/分裂的動(dòng)態(tài)平衡中及維持線粒體和細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用，具有抗細(xì)胞凋亡作用，包括卵巢、神經(jīng)元和缺血/再灌注損傷后的心臟[9-13]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以明顯減少膿毒癥小鼠T淋巴細(xì)胞的凋亡，并且能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞Mfn2表達(dá)[14-15]。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）模型，利用腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染調(diào)控Mfn2表達(dá)，觀察Mfn2在姜黃素干預(yù)膿毒癥T淋巴細(xì)胞凋亡中的作用，從線粒體融合和切割的角度揭示姜黃素在膿毒癥時(shí)對(duì)細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性Balb/c小鼠165只，體重20～25g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。25°C 恒溫（濕度 50%）和12h光照/12h黑暗周期性變化條件下飼養(yǎng)。適應(yīng)環(huán)境7d后，隨機(jī)分成以下8組：假手術(shù)組、膿毒癥組、姜黃素干預(yù)組、姜黃素對(duì)照組、Mfn2干擾膿毒癥組、Mfn2干擾姜黃素治療組、陰性對(duì)照病毒膿毒癥組、陰性對(duì)照病毒姜黃素組，每組15只；剩余小鼠隨機(jī)分為正常組、陰性病毒組、Mfn2干擾組，用于檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率，每組15只。通過(guò)CLP誘導(dǎo)小鼠膿毒癥模型[16]。給予水但不給食物過(guò)夜后，予戊巴比妥鈉40～80mg/kg麻醉小鼠。將暴露的盲腸從自由端1cm處結(jié)扎，并在中間用21G針刺破，糞便被壓出以確保穿刺的通暢性。然后返回腸環(huán)，關(guān)閉腹壁。此后，皮下給予0.9%氯化鈉注射液1ml進(jìn)行液體復(fù)蘇。假手術(shù)組除了盲腸未結(jié)扎或穿刺外，對(duì)小鼠進(jìn)行相同的手術(shù)。在最初6h內(nèi)，存活率為100%，且小鼠出現(xiàn)抑郁和腹瀉等典型癥狀，表明建模成功。CLP后72h的病死率約為40%～60%。姜黃素干預(yù)組及姜黃素對(duì)照組予灌胃姜黃素200mg/（kg·d）1周（姜黃素溶解在玉米油中），陰性病毒膿毒癥組及陰性病毒姜黃素組通過(guò)尾靜脈注射陰性腺相關(guān)病毒建立模型，Mfn2干擾膿毒癥組及Mfn2干擾姜黃素組通過(guò)尾靜脈注射攜帶Mfn2干擾序列腺相關(guān)病毒建立模型。

1.2 主要試劑和儀器 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；姜黃素（美國(guó)Sigma公司）；玉米油（上海太陽(yáng)能生物科技有限公司）。凋亡試劑盒（美國(guó)BD公司）；小鼠脾臟組織淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司）；兔抗小鼠Mfn2單抗（英國(guó) Abcam 公司）；兔抗小鼠 Bcl-2、Bax、β-actin單抗、山羊抗兔二抗（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。

1.3 方法

1.3.1 腺相關(guān)病毒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 攜帶Mfn2干擾序列的腺相關(guān)病毒載體由中國(guó)上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。根據(jù)制造商的說(shuō)明，陰性病毒組小鼠將陰性病毒液通過(guò)尾靜脈注射滴度為1.38×1012g/ml的腺相關(guān)病毒，Mfn2干擾組用同樣方法注射攜帶eGFP的滴度為3.32×1012g/ml重組腺相關(guān)病毒。2周后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，固定、消毒后取小鼠脾臟，進(jìn)行冰凍切片后于熒光顯微鏡下觀察脾臟組織熒光強(qiáng)弱。通過(guò)Western blot法檢測(cè)陰性病毒以及下調(diào)后脾臟淋巴細(xì)胞的Mfn2表達(dá)水平，Western blot法檢測(cè)步驟見(jiàn)1.3.3。通過(guò)以上方法檢測(cè)腺相關(guān)病毒的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，取陰性病毒膿毒癥組、陰性病毒姜黃素組、Mfn2干擾組膿毒癥組、Mfn2干擾組姜黃素組小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.2 脾單個(gè)核細(xì)胞的分離 8組小鼠CLP建模后24h采用頸椎脫臼法處死，固定、消毒后取小鼠脾臟，置于含有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)，剝?nèi)テ⑴K被膜并放至大培養(yǎng)皿上的400目篩網(wǎng)上，輕輕研磨，用PBS沖洗、過(guò)濾，收集細(xì)胞懸浮液。1 500r/min離心10min，棄上清液。以4ml PBS重新懸浮細(xì)胞，加入4ml小鼠器官淋巴細(xì)胞分離液，差速離心機(jī)3 000r/min離心15min，取第二層霧化細(xì)胞層，以預(yù)冷的PBS洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 Western blot法檢測(cè) Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞收集后，用預(yù)冷的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)將細(xì)胞破碎3次，然后在4℃以14 000r/min離心20min。使用BCA方法檢測(cè)上清液中的蛋白質(zhì)濃度后將蛋白質(zhì)與適當(dāng)?shù)腟DS上樣緩沖液混合，然后在95℃下煮沸5min。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中分離蛋白質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。在室溫下用5%脫脂乳封閉2h后，將膜與抗-Mfn2（1：1 000）和抗 β-actin（1∶1 000）抗體在4℃下過(guò)夜孵育。此外，孵育Caspase-3、Bcl-2、Bax抗體需要12%Tris-HCl十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠。然后，與辣根過(guò)氧化物酶-（HRP-）綴合的山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1h。TBST洗滌后，使用ECL顯影，用圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況 通過(guò)離心收集的細(xì)胞（以1 000r/min離心8min）用PBS洗滌細(xì)胞2次（以1 000r/min離心8min），并收集約5×105個(gè)細(xì)胞。隨后，加入500μl 1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，然后加入5μl的膜聯(lián)蛋白V-FITC和5μl的 PI，在室溫下混合，避光，并孵育反應(yīng)15min。在1h內(nèi)通過(guò)使用FACSCalibur（BD Biosciences，Mountain View，CA）流式細(xì)胞儀分析各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 線粒體膜電位 取5×105個(gè)細(xì)胞，重懸于0.5ml PBS中，加入0.5ml JC-1染色工作液，倒置數(shù)次混合，然后置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中20min。孵育后，將細(xì)胞在4℃下以600g離心4min，沉淀細(xì)胞，除去上清液，用預(yù)冷的1×JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后重懸于適當(dāng)?shù)腏C-1染色緩沖液。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，以單體存在時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)到綠色熒光，而以多聚體存在時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)到紅色熒光。JC-1單體和多聚體之間轉(zhuǎn)變可逆，當(dāng)細(xì)胞凋亡增加時(shí)，多轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w狀態(tài)。在1h內(nèi)通過(guò)使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞。

圖1 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)下調(diào)Mfn2（a：正常組；b：陰性病毒組；c：Mfn2干擾組）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 3組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Mfn2表達(dá)水平的比較（與正常組比較，*P＜0.05；與陰性對(duì)照組比較，△P＜0.05）

2 結(jié)果

2.1 Mfn2干擾腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證 小鼠尾靜脈注射攜帶eGFP的腺相關(guān)病毒后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，Mfn2干擾組小鼠脾臟可見(jiàn)明顯的綠色熒光（圖1，插頁(yè)），提示病毒已轉(zhuǎn)染小鼠脾臟組織。提取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞通過(guò)Western blot檢測(cè)Mfn2干擾組小鼠轉(zhuǎn)染效率為0.156±0.027，相對(duì)于正常組小鼠的0.423±0.113明顯降低（P＜0.01），下調(diào)程度＞60%，說(shuō)明Mfn2下調(diào)有效，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2）。

2.2 姜黃素干預(yù)對(duì)膿毒癥T淋巴細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組、膿毒癥組、姜黃素干預(yù)組以及姜黃素對(duì)照組T淋巴細(xì)胞凋亡率分別為（21.017±8.564）%、（50.733±6.802）%、（29.020±0.563）%、（29.810±1.745）%，4 組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組淋巴細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組明顯增加（P＜0.01）；與膿毒癥組相比，姜黃素干預(yù)組淋巴細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），而姜黃素對(duì)照組與假手術(shù)組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

2.3 姜黃素干預(yù)對(duì)膿毒癥T淋巴細(xì)胞線粒體膜電位的影響 經(jīng)CLP造模后，脾臟淋巴細(xì)胞從原先的紅光多聚體慢慢釋放為綠光單體，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而姜黃素干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，JC-1重新轉(zhuǎn)化為紅光多聚體，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明姜黃素干預(yù)后，造模后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡明顯減少（圖4，插頁(yè)）。

2.4 姜黃素對(duì)膿毒癥小鼠T淋巴細(xì)胞Mfn2表達(dá)的影響 膿毒癥組小鼠在造模24h后取脾臟T淋巴細(xì)胞，Mfn2表達(dá)（0.473±0.579）較假手術(shù)組（2.576±1.139）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；姜黃素干預(yù)后，膿毒癥組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的Mfn2表達(dá)（2.489±0.874）較膿毒癥組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而姜黃素對(duì)照組（2.034±1.337）小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的Mfn2表達(dá)與假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖 5）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡（采取右上象限以及右下象限之和來(lái)比較各組間的凋亡差異；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與膿毒癥組比較，△P＜0.05）

圖4 流式細(xì)胞術(shù)線粒體膜電位的檢測(cè)（右下角數(shù)值代表膜電位降低率；與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與膿毒癥組相比，△P＜0.05）

圖5 各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的Mfn2表達(dá)水平（與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與膿毒癥組比較，**P＜0.05）

2.5 下調(diào)Mfn2后，姜黃素對(duì)膿毒癥中淋巴細(xì)胞凋亡作用的影響 陰性病毒姜黃素組（25.347±4.099）與陰性病毒膿毒癥組（45.507±4.527）比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。而 Mfn2干擾姜黃素組（33.010±3.721）較 Mfn2干擾膿毒癥組（27.490±1.595）高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性病毒膿毒癥組比較，Mfn2干擾膿毒癥組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6），說(shuō)明下調(diào)Mfn2后，姜黃素對(duì)膿毒癥小鼠淋巴細(xì)胞凋亡作用的影響降低或者消失。陰性病毒姜黃素組線粒體膜電位降低率較陰性病毒膿毒癥組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Mfn2干擾姜黃素組線粒體膜電位較Mfn2干擾膿毒癥組稍有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7，插頁(yè)）。

2.6 下調(diào)Mfn2后，姜黃素對(duì)膿毒癥小鼠Caspase-3、Bcl-2/Bax表達(dá)的影響 與假手術(shù)組Caspase-3（0.615±0.146）相比，膿毒癥組（1.935±0.145）小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），姜黃素干預(yù)組（0.868±0.202）較膿毒癥組明顯升高（P＜0.05）。當(dāng)Mfn2下調(diào)后，與Mfn2干擾膿毒癥組（1.954±0.770）相比，Mfn2干擾姜黃素干預(yù)組 Caspase-3（1.816±0.075）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組Bcl-2/Bax（1.397±0.272）相比，膿毒癥組（0.269±0.101）小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的明顯降低（P＜0.05），姜黃素干預(yù)組（2.060±1.217）較膿毒癥組明顯升高（P＜0.05）。當(dāng)Mfn2下調(diào)后，與Mfn2干擾膿毒癥組（1.014±0.601）相比，Mfn2干擾姜黃素干預(yù)組（0.963±0.276）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖 8）。

3 討論

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類生命健康。大量研究表明，大多數(shù)晚期膿毒癥患者死于免疫抑制而非僅限于炎癥反應(yīng)[17-18]。在膿毒癥期間，存在大量T淋巴細(xì)胞凋亡，免疫功能紊亂，是組織器官功能障礙和死亡的重要原因[19-20]。迄今為止，膿毒癥治療仍缺乏特效的藥物[21]。姜黃素是一種姜科植物姜黃中提取的多酚類物質(zhì)，是姜黃的主要活性成分之一[22-23]。已被許多研究證實(shí)用于治療膿毒癥，但其具體機(jī)制尚不清楚。Rana等[24]證明姜黃素提取物可以調(diào)節(jié)IPAK-MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。而Siddiqui等[25]在一項(xiàng)前瞻性研究中也指出姜黃素可能是通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ的上調(diào)對(duì)膿毒癥小鼠有治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制膿毒癥T淋巴細(xì)胞凋亡，預(yù)先給予姜黃素保護(hù)則顯著上調(diào)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的比例，進(jìn)而降低膿毒癥炎癥反應(yīng)和器官損傷[26]。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡（與陰性病毒膿毒癥組比較，*P＜0.05）

圖7 流式細(xì)胞術(shù)線粒體膜電位的檢測(cè)（與陰性病毒膿毒癥組相比，*P＜0.05）

圖8 Western blot法檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2/Bax表達(dá)水平（與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與膿毒癥組比較，**P＜0.05；與陰性病毒姜黃素干預(yù)組比較，***P＜0.05）

早在2008年Weber等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥中，T淋巴細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞凋亡，并提出該細(xì)胞在膿毒癥中起重要作用。細(xì)胞凋亡主要通過(guò)死亡受體活化途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑3條途徑調(diào)控，其中線粒體途徑在細(xì)胞凋亡過(guò)程中最為重要。線粒體是一種動(dòng)態(tài)細(xì)胞器，根據(jù)細(xì)胞的需要，不斷移動(dòng)，融合和分裂，形成動(dòng)態(tài)平衡[28-29]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，這種線粒體穩(wěn)態(tài)對(duì)先天免疫反應(yīng)和T細(xì)胞功能有重要影響[30-31]。膿毒癥期間，線粒體穩(wěn)態(tài)失衡是其導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及器官衰竭的重要原因之一。其中Mfn2是治療許多疾病的靶基因，也是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠的Mfn2表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，而姜黃素干預(yù)后，Mfn2表達(dá)較膿毒癥組升高，符合姜黃素改善線粒體重塑的研究[34]。

本研究中同樣發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效抑制膿毒癥小鼠淋巴細(xì)胞線粒體途徑凋亡，而T淋巴細(xì)胞凋亡的減少可以降低膿毒癥小鼠的死亡率，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，并對(duì)膿毒癥起到保護(hù)作用[35-36]。Bcl-2是凋亡抑制蛋白，而B(niǎo)ax是凋亡促進(jìn)蛋白，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞受到凋亡刺激的情況下，細(xì)胞質(zhì)中Bax蛋白轉(zhuǎn)移到線粒體中。Bcl-2/Bax變化能準(zhǔn)確的反映細(xì)胞凋亡情況，膿毒癥組較正常組明顯降低，而姜黃素組該比值較膿毒癥組升高；Caspase-3是一種經(jīng)常被激活的死亡蛋白酶，催化許多關(guān)鍵細(xì)胞蛋白的特異性切割，對(duì)于細(xì)胞的解體和凋亡小體的形成相關(guān)的某些過(guò)程是必需，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以降低膿毒癥Caspase-3的高表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)和線粒體膜電位也進(jìn)一步明確了姜黃素的作用。而下調(diào)Mfn2后，姜黃素的上述作用較上調(diào)前明顯降低，說(shuō)明姜黃素是通過(guò)Mfn2來(lái)降低淋巴細(xì)胞凋亡。此外，還需要進(jìn)一步研究以提高其生物利用度，如納米粒子12或環(huán)孢菌素納米乳劑[37]，或通過(guò)藥物和其他方法的組合來(lái)提高姜黃素的療效[38]。

總之，姜黃素可通過(guò)Mfn2導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡減少，從而增強(qiáng)膿毒癥小鼠的免疫功能。本研究表明，姜黃素干預(yù)對(duì)膿毒癥小鼠有保護(hù)作用，并且該作用依賴于Mfn2。雖然已經(jīng)證實(shí)Mfn2在這方面發(fā)揮了作用，但仍有必要進(jìn)一步研究其確切的機(jī)制。