WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白在上皮性卵巢漿液性癌中的表達(dá)及臨床意義

楊尊敬，杜先玲

恩施自治州中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 恩施445000

卵巢漿液性癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤之一[1]，其預(yù)后較差，短期內(nèi)腫瘤病情進(jìn)展速度較快，患者的總體生存時間較短[2]。在揭示卵巢漿液性癌發(fā)病機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變、免疫調(diào)節(jié)紊亂等，均可影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢上皮性惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。無翅型MMTV整合位點家族成員1（wingless-type MMTV integration site family member 1，WNT1）/β-聯(lián)蛋白（β-catenin）信號通路是一種重要的保守性信號通路，該通路相關(guān)信號蛋白的激活，能夠通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及上皮細(xì)胞的異常分化，影響腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[4-5]。程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）是 B7家族共刺激分子配體，能夠抑制T淋巴細(xì)胞的免疫功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[6]。為了揭示W(wǎng)NT1、β-catenin、PD-L1的表達(dá)與卵巢漿液性癌的關(guān)系，為臨床上卵巢漿液性癌的診療提供參考，本研究對上皮性卵巢漿液性癌患者WNT1、β-catenin、PD-L1的表達(dá)水平及其與患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年1月至2017年10月于恩施自治州中心醫(yī)院腫瘤科住院并行手術(shù)治療的上皮性卵巢漿液性癌患者200例，并收集患者的卵巢漿液性癌組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)常規(guī)病理檢查確診為上皮性卵巢漿液性癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受放療、化療等抗腫瘤治療者；②合并其他部位腫瘤者；③肝腎功能嚴(yán)重不全者；④患有自身免疫性疾病者；⑤凝血功能障礙者。另外，選取同時期于恩施自治州中心醫(yī)院因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)及附件切除術(shù)的患者120例，并選取經(jīng)病理檢查確診的正常卵巢組織為對照。上皮性卵巢漿液性癌患者的年齡為38～70歲，平均年齡（55.3±11.9）歲；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期59例，Ⅲ～Ⅳ期141例；分化程度：高分化78例，低分化122例。子宮肌瘤患者的年齡為36～69歲，平均年齡（54.1±10.8）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有患者及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

選取卵巢漿液性癌組織和正常卵巢組織，大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，常規(guī)制作石蠟切片，采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP）檢測不同組織中WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白的表達(dá)情況。具體方法：采用石蠟進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次3～5 min，8%蛋白粉封閉液封閉2 h，棄去封閉液后加入一抗[兔來源，1∶（1000～1500）]，4℃冰箱過夜，PBS沖洗3次，每次3～5 min，加入二抗[鼠來源，1∶（400～500）]，室溫孵育20～30 min，PBS沖洗3次，每次3～5 min，加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的標(biāo)記物，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3～5 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色，復(fù)染、脫水、封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

以細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例和著色強(qiáng)度進(jìn)行半定量判定。根據(jù)著色強(qiáng)度判定：不著色為0分，淺黃色為1分，黃棕色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例判定：選擇5～10個高倍視野，計算1000個細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占比例，陽性細(xì)胞所占比例＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將著色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞所占比例評分相加，0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為強(qiáng)陽性（++），5～7分為極強(qiáng)陽性（+++）。陽性率=（弱陽性+強(qiáng)陽性+極強(qiáng)陽性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料比較采用Mann-Whitney秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白表達(dá)情況的比較

卵巢漿液性癌組織與正常卵巢組織中WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=10.698、12.397、9.450，P＜0.01）。卵巢漿液性癌組織中WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率分別為94.00%（188/200）、97.50%（195/200）、84.50%（169/200），均明顯高于正常卵巢組織的73.33%（88/120）、69.17%（83/120）、45.83%（55/120），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=27.011、52.803、53.397，P＜0.01）。（表1）

表1 卵巢漿液性癌組織與正常卵巢組織中WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白的表達(dá)情況[n（%）]*

2.2 卵巢漿液性癌組織中WNT 1蛋白表達(dá)與上皮性卵巢漿液性癌患者臨床特征的關(guān)系

不同F(xiàn)IGO分期上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中WNT1蛋白的表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=5.250，P＜0.01）；FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中WNT1蛋白的陽性表達(dá)率為98.58%（139/141），明顯高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期患者的83.05%（49/59），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=17.789，P＜0.01）。不同分化程度上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中WNT1蛋白的表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中WNT1蛋白的表達(dá)情況（n=200）

2.3 卵巢漿液性癌組織中 β-catenin蛋白表達(dá)與上皮性卵巢漿液性癌患者臨床特征的關(guān)系

不同F(xiàn)IGO分期、分化程度上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中β-catenin蛋白的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.363、3.309，P＜0.05）。FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中β-catenin蛋白的陽性表達(dá)率為99.29%（140/141），高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期患者的93.22%（55/59），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.288，P=0.012）；低分化上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中β-catenin蛋白的陽性表達(dá)率為97.54%（119/122），與高分化患者的97.44%（76/78）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.002，P=0.963）。（表3）

表3 不同臨床特征上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中 β-catenin蛋白的表達(dá)情況（n=200）

2.4 卵巢漿液性癌組織中PD-L 1蛋白表達(dá)與上皮性卵巢漿液性癌患者臨床特征的關(guān)系

不同F(xiàn)IGO分期、分化程度上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中PD-L1蛋白的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=3.963、2.534，P＜0.05）。FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率為90.78%（128/141），明顯高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期患者的69.49%（41/59），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.393，P＜0.01）；低分化上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率為86.89%（106/122），與高分化患者的80.77%（63/78）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.386，P=0.538）。（表4）

表4 不同臨床特征上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中PD-L 1蛋白的表達(dá)情況（n=200）

3 討論

卵巢漿液性癌占所有類型卵巢上皮性惡性腫瘤的25%以上[7-9]。免疫靶向治療在卵巢惡性腫瘤的治療過程中發(fā)揮著重要作用，因而本研究對上皮性卵巢漿液性癌患者體內(nèi)不同腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在揭示卵巢漿液性癌的生物學(xué)進(jìn)展機(jī)制，為臨床上卵巢漿液性癌患者免疫靶向治療中靶點的選擇提供參考。

WNT1、β-catenin為 WNT1/β-catenin信號通路上的效應(yīng)分子，WNT1/β-catenin信號通路的激活能夠上調(diào)WNT1、β-catenin蛋白的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞的持續(xù)性自我擴(kuò)增的速度。相關(guān)研究表明，WNT1、β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，能夠提高卵巢腫瘤細(xì)胞的變形能力及對臨近正常盆腔臟器組織的浸潤和黏附能力，進(jìn)而促進(jìn)卵巢漿液性癌的轉(zhuǎn)移[10]；PD-L1是共刺激分子家族成員，其與淋巴細(xì)胞膜表面Fas配體結(jié)合，可以顯著抑制T淋巴細(xì)胞的活化，降低抗原呈遞細(xì)胞的抗原體呈遞功能，降低CD4+T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答水平，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。相關(guān)研究顯示，PD-L1的表達(dá)不僅能夠參與卵巢腫瘤患者的免疫抑制過程，同時還能夠降低腫瘤細(xì)胞核DNA的錯配修復(fù)能力，導(dǎo)致癌基因異常突變風(fēng)險的顯著上升[11]。部分研究者探討了WNT1、β-catenin在卵巢漿液性癌患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為WNT1、β-catenin表達(dá)水平升高與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)[10]，但缺乏對于卵巢漿液性癌這一特定腫瘤類型的具體分析，同時對于PDL1的分析探討仍然不足。

本研究結(jié)果顯示，卵巢漿液性癌組織中WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于正常卵巢組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示W(wǎng)NT1、β-catenin、PD-L1蛋白均可能參與卵巢漿液性癌的發(fā)生過程。究其原因可能主要與WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白的下列兩個方面的作用有關(guān)[12-13]：①WNT1、β-catenin蛋白表達(dá)水平升高能夠促進(jìn)相關(guān)信號通路的激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)性擴(kuò)增；②PD-L1蛋白表達(dá)上調(diào)，能夠通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌抑制性免疫分子轉(zhuǎn)化生長因子-β，降低自然殺傷性T淋巴細(xì)胞的活性，抑制其對腫瘤細(xì)胞的殺傷和吞噬效果，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲過程。李杉等[14]研究認(rèn)為，在部分卵巢漿液性癌患者病灶組織中，β-catenin蛋白的陽性表達(dá)率可平均上升40%以上，特別是在特殊類型如漿液性腺癌或乳頭狀癌患者中，β-catenin的表達(dá)水平上升更為明顯；免疫組化結(jié)果顯示，WNT1、β-catenin主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜周邊，而PD-L1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞間質(zhì)中，推測這主要由于WNT1、β-catenin能夠影響到腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜上相關(guān)受體的激活，而PD-L1主要通過影響腫瘤細(xì)胞間免疫抑制因子的表達(dá)等有關(guān)。本研究在探討WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白表達(dá)與卵巢漿液性癌患者臨床特征的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢漿液性癌患者卵巢漿液性癌組織中WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率均高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示W(wǎng)NT1、β-catenin、PD-L1蛋白表達(dá)水平增高與上皮性卵巢漿液性癌患者的病情進(jìn)展密切相關(guān)，這主要由于相關(guān)指標(biāo)的上升，能夠提高腫瘤細(xì)胞的浸潤能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對遠(yuǎn)處器官的侵襲。

綜上所述，在卵巢漿液性癌患者中，WNT1、β-catenin、PD-L1蛋白的表達(dá)水平均升高，而且其表達(dá)水平與上皮性卵巢漿液性癌患者的臨床分期密切相關(guān)。