survivin和MCM7在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及其與患者臨床特征的關(guān)系

李偉，李永紅，江暉

天門市第一人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 天門431700

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤。有研究發(fā)現(xiàn)，在不同的國家和地區(qū)，甲狀腺癌的構(gòu)成比大體相同，其中，甲狀腺乳頭狀癌尤為常見，約占甲狀腺癌的60%～94%[1-2]。甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生可能與基因變異、遺傳、碘攝入異常等因素有關(guān)，多發(fā)于女性，易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。目前，外科手術(shù)、131I治療和促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）抑制治療等為治療甲狀腺乳頭狀癌的主要方法，但手術(shù)往往會損傷喉返神經(jīng)和甲狀旁腺，不僅會改變患者的音調(diào)，嚴(yán)重時還會引起患者發(fā)生窒息，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響[3-4]。因此，除了應(yīng)提高手術(shù)操作的技術(shù)，避免造成上述損傷外，還應(yīng)尋求更為靈敏的生物學(xué)指標(biāo)，以用來區(qū)分甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性腫瘤，并觀察是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而為是否需要進行手術(shù)治療或選擇合適的手術(shù)方案提供依據(jù)。存活蛋白（survivin）是一種穿梭蛋白，與細胞周期密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，survivin在正常組織中不表達，而在惡性腫瘤組織中高表達[5]。微小染色體維持蛋白 7（minichromosome maintenance protein 7，MCM7）是一組與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）復(fù)制密切相關(guān)的蛋白，為保證遺傳物質(zhì)精確傳遞至子代，在一個細胞周期中DNA僅能復(fù)制一次，因此，當(dāng)DNA復(fù)制完成，MCM7就會出現(xiàn)磷酸化，以確保其只進行一次復(fù)制。但也有研究表明，MCM7在惡性腫瘤組織中過表達，促使DNA出現(xiàn)多次復(fù)制，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[6-7]。本研究采用了免疫組織化學(xué)染色法檢測survivin和MCM7在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達情況，并分析其與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，從而探討二者在甲狀腺癌乳頭狀癌中的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2017年12月天門市第一人民醫(yī)院收治的經(jīng)外科手術(shù)切除且石蠟包埋的甲狀腺疾病患者，并取得甲狀腺病變組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未進行放化療、免疫治療和生物學(xué)治療等；②臨床資料完整；③術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后復(fù)發(fā)；②合并遠處臟器轉(zhuǎn)移；③初次手術(shù)后原發(fā)灶有腫瘤組織殘留。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入120例甲狀腺疾?。?0例甲狀腺乳頭狀癌、35例甲狀腺腺瘤、35例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫）患者。50例甲狀腺乳頭狀癌中，男10例，女40例；年齡為21～70歲，平均年齡為（42.1±5.4）歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期35例。35例甲狀腺腺瘤患者中，男7例，女28例；年齡為22～69歲，平均年齡為（42.4±5.1）歲。35例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者中，男8例，女27例；年齡為21～70歲，平均年齡為（42.0±4.9）歲。3組患者的性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要抗體與試劑

兔抗人survivin和MCM7多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、蘇木素、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

術(shù)后采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測survivin和MCM7在3種甲狀腺病變組織中的表達情況。具體方法：取出組織標(biāo)本，采用石蠟包埋進行連續(xù)切片，置入40%的乙醇中，然后水浴40℃，4 min，進行展開，置于60℃烘箱中進行烘片。采用二甲苯脫蠟20 min，采用梯度乙醇進行水化，采用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液對survivin和MCM7進行修復(fù)，然后加入3%的雙氧水，室溫10 min，從而阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，加入5%的羊血孵育30 min，除去封閉液，加入一抗，置于4℃冰箱過夜，次日取出并使用PBS沖洗，加入DAB顯色劑，再次使用PBS沖洗終止顯色，使用蒸餾水沖洗，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水干燥，鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷

免疫組織化學(xué)陽性染色結(jié)果表現(xiàn)為細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。survivin陽性表達于細胞質(zhì)中，MCM7陽性表達于細胞核和細胞質(zhì)中。根據(jù)染色強度進行評分：無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分。依據(jù)陽性細胞所占比例進行評分：陽性細胞所占比例為0～5%計0分，陽性細胞所占比例為6%～25%計1分，陽性細胞所占比例為26%～50%計2分，陽性細胞所占比例為51%～75%計3分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相加，＞2分為陽性表達，≤2分為陰性表達[8]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同類型甲狀腺病變組織中survivin和MCM7的表達情況

3種類型甲狀腺病變組織中survivin和MCM7的陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=61.911、62.393，P＜0.01）。甲狀腺乳頭狀癌組織中survivin和MCM7的陽性表達率均高于甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中survivin和MCM7的陽性表達率均低于甲狀腺腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1、圖1）

表1 不同類型甲狀腺病變組織中survivin和MCM 7的陽性表達情況的比較[n（%）]

圖1 不同類型甲狀腺病變組織中survivin和MCM7的表達情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.2 不同臨床特征甲狀腺乳頭狀癌患者甲狀腺乳頭狀癌組織中survivin和MCM7的表達情況

不同性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、包膜是否完整、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況甲狀腺乳頭狀癌患者甲狀腺乳頭狀癌組織中survivin的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同性別、年齡、包膜是否完整甲狀腺乳頭狀癌患者甲狀腺乳頭狀癌組織中MCM7的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤直徑＞2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺乳頭狀癌患者甲狀腺乳頭狀癌組織中MCM7的陽性表達率均高于腫瘤直徑≤2 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.255、4.233、8.589，P＜0.05）。（表2）

2.3 相關(guān)性分析

對甲狀腺乳頭狀癌患者甲狀腺乳頭狀癌組織中survivin和MCM7表達的相關(guān)性進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，survivin與MCM7在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達呈正相關(guān)（r=0.612，P＜0.01）。（表3）

表2 50例不同臨床特征甲狀腺乳頭狀癌患者甲狀腺乳頭狀癌組織中survivin和MCM 7的陽性表達情況

表3 甲狀腺乳頭狀癌組織中survivin和MCM 7表達的相關(guān)性

3 討論

近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增加，引起了國內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。影響甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生的因素有很多，包括腫瘤直徑、分化程度、是否浸潤血管等。其治療失敗的主要原因是腫瘤細胞發(fā)生了侵襲與轉(zhuǎn)移[9]。survivin是一種凋亡抑制蛋白，在細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移方面均起著重要的作用。大量研究表明，survivin在惡性腫瘤（如乳腺癌、喉鱗狀細胞癌）中過表達，其能夠抑制caspase 7和caspase 9的活性，從而抑制腫瘤細胞的凋亡，參與細胞周期的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)[10-12]。本研究結(jié)果顯示，survivin在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達率高于甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織（P＜0.05），與劉松[13]的研究結(jié)果一致，提示survivin表達水平的升高促使細胞異常增生并向惡性方向轉(zhuǎn)化。本研究分析了survivin的陽性表達情況與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，其可能與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、包膜是否完整、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均無關(guān)。而與王海瑩[14]的研究結(jié)果不同，其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)survivin在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達情況與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能有關(guān)，分析其原因可能是由于本研究納入的樣本數(shù)量較少有關(guān)。

MCM7是細胞周期調(diào)控過程中的主要成分，參與細胞DNA的復(fù)制。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測其在3種甲狀腺病變組織中的表達情況，結(jié)果顯示，MCM7在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達率為90.0%，高于甲狀腺腺瘤組織中的28.6%和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中的8.6%。Haruki等[15]通過免疫組織化學(xué)法檢測微小肺腺癌組織中MCM7的表達情況，結(jié)果顯示，MCM7的表達情況與肺腺癌分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況可能有關(guān)，可以用來評估肺腺癌患者的預(yù)后。Almadori等[16]研究結(jié)果顯示MCM7過表達與喉癌的發(fā)生有關(guān)，可以將其作為預(yù)測喉癌患者預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志物。本研究通過分析MCM7與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，MCM7的陽性表達可能與患者的性別、年齡、包膜是否完整無關(guān)，而可能與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，提示其在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性腫瘤的鑒別方面具有重要的臨床意義。進一步進行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示，survivin和MCM7在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達呈正相關(guān)，提示二者存在協(xié)同或者相互促進的關(guān)系。

綜上所述，survivin和MCM7的高表達可能是甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中重要的一個環(huán)節(jié)，為臨床甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性腫瘤的鑒別提供依據(jù)。