張猛,沙林,馬慶防,安剛,于如同,黎軍#
1徐州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,江蘇 徐州221000
2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,江蘇 徐州221000
惡性膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,其惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差,即使采用手術(shù)、放療和化療等綜合治療手段,療效仍不理想,主要是由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞無限增殖所致。因此,探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞無限增殖的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)潛在的分子治療靶點(diǎn),開展腫瘤分子靶向治療是當(dāng)今腫瘤研究領(lǐng)域的趨勢(shì)與熱點(diǎn)。遺傳技術(shù)和生物學(xué)技術(shù)分析表明,高爾基體磷蛋白3(golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)是一個(gè)全新的癌基因,能促進(jìn)人類腫瘤細(xì)胞的增殖[1]。在對(duì)GOLPH3調(diào)節(jié)高爾基體的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究中發(fā)現(xiàn),VPS35能夠與GOLPH3相互作用調(diào)控囊泡運(yùn)輸。通過這些發(fā)現(xiàn)可以推斷GOLPH3、VPS35可能是蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的關(guān)鍵分子,并且影響WNT信號(hào)通路下游信號(hào)發(fā)揮一系列的作用。WNT/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路的激活參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展,有可能成為治療膠質(zhì)瘤的新靶點(diǎn)。因此,本研究擬采用膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系為研究對(duì)象,應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、EdU等方法,檢測GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響,闡明GOLPH3通過調(diào)節(jié)WNT/β-catenin信號(hào)通路影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,為膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供新的潛在靶點(diǎn)。
U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。siRNA oligo由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成,兔抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體購自美國Millipore Chemicon公司,兔抗GOLPH3單克隆抗體、兔抗WNT2單克隆抗體、兔抗G1/S-特異性細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)單克隆抗體、山羊抗VPS35單克隆抗體、兔抗β-catenin單克隆抗體均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。其他常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。
U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞呈貼壁生長。待細(xì)胞長滿瓶底后,棄掉培養(yǎng)液,用0.25%胰蛋白酶消化,2~3天后分瓶傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
將轉(zhuǎn)染negative control siRNA oligo和各siRNA oligo的細(xì)胞分別設(shè)為陰性對(duì)照組(siNC組)和下調(diào)組(siGOLPH3組、siWNT2組、siβ-catenin組)。將GOLPH3、WNT2、β-catenin基因序列交于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成目的小干擾序列及陰性對(duì)照小干擾序列。negative control siRNA oligo正義:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3',negative control siRNA oligo反義5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3';GOLPH3-siRNA oligo正義:5'-GUUAAGAAAUGUACGGGAATT-3',GOLPH3-siRNA oligo反義:5'-UUACAGAUUACCUUUCUUGTT-3';WNT2-siRNA oligo正義:5'-GACGAUGGGAAGCGCCAAGTT-3',WNT2-siRNA oligo反義:5'-CUUGGCGCUU-CCCAUCUUCTT-3';β-catenin siRNA oligo正義:5'-CAUGCAGAAUACAAAUGAUTT-3',β-catenin siRNA oligo反 義 :5'-GUACGUCUUAUGUUUACUATT-3'。 將脂質(zhì)體與siRNA按1∶2混合,每孔用量為脂質(zhì)體5μl,siRNA 10μl,各用 opti-MEM 培養(yǎng)基 250μl稀釋,室溫靜置5 min,將兩者混勻室溫靜置孵育20 min,然后直接將混合物加入6孔板中。輕輕搖晃混勻,于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h后換為含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),48 h后收集細(xì)胞。
EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物,能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA中,通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測細(xì)胞DNA復(fù)制活性,染色后熒光顯微鏡下增殖期細(xì)胞核呈紅色。Hoechst33342染色液是一種適用于活細(xì)胞細(xì)胞核染色的溶液,染色后熒光顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光,本研究通過檢測熒光強(qiáng)度而統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的增殖情況。
1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染方法同上,共設(shè) siNC組、siGOLPH3組、siWNT2組、siβcatenin組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,采用EdU實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染效果及細(xì)胞增殖率。
1.4.2 EdU標(biāo)注 將細(xì)胞培養(yǎng)基按1000∶1的比例稀釋EdU溶液,制備適量50 μmol/L EdU培養(yǎng)基;每孔加入100 μl 50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h,棄培養(yǎng)基;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗細(xì)胞2次,每次5 min。
1.4.3 細(xì)胞固定 每孔加50 μl細(xì)胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS),室溫孵育30 min,棄固定液;每孔加入50 μl 2 mg/ml的甘氨酸,脫色搖床孵育5 min,棄甘氨酸溶液;每孔加入100 μl PBS,脫色搖床清洗5 min,棄PBS;每孔加入100 μl滲透劑(含0.5%Triton X-100的PBS),脫色搖床孵育 10 min,PBS清洗5 min。
1.4.4 Apollo染色 每孔加入100 μl的1×Apollo染色反應(yīng)液,避光,室溫,脫色搖床孵育30 min后,棄反應(yīng)液;加入100 μl滲透劑(含0.5%Triton X-100的PBS)脫色搖床清洗3次,每次10 min,棄滲透劑;每孔加入100 μl甲醇清洗2次,每次5 min,PBS清洗5 min。
1.4.5 DNA染色 用去離子水按100∶1的比例稀釋Hoechst33342反應(yīng)液,制備適量1×Hoechst33342反應(yīng)液,避光保存;每孔加入100 μl 1×Hoechst33342反應(yīng)液,避光,室溫,脫色搖床孵育30 min后,棄染色反應(yīng)液;每孔加入100 μl PBS清洗3次,每次10 min。
1.4.6 獲取圖像 熒光顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)100倍視野,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)(Hoechst)及增殖的細(xì)胞總數(shù)(EdU),計(jì)算增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。
1.5.1 提取細(xì)胞總蛋白U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA48 h后,吸出培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS洗3遍,每孔加入200μl含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min,后將細(xì)胞碎片和裂解液移到1.5 ml的離心管中,4℃、12 000 r/min離心25 min,取上清轉(zhuǎn)移至無菌EP管中,檢測蛋白濃度后分裝到EP管中-80℃保存,取80μg蛋白樣品加入蛋白上樣液后煮沸5 min,上樣。
1.5.2 制膠、電泳和轉(zhuǎn)膜 配制10%分離膠和6%濃縮膠,80μg蛋白樣品上樣,100 mV、100 min電泳,電泳結(jié)束后,將聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)后的凝膠浸泡到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液中平衡5 min。聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜在甲醇中浸泡3 min,活化后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液中平衡5 min,再置于電泳膠上,用剪刀修剪膜邊緣,使其略大于膠的邊緣,玻璃棒趕除氣泡。將膜與膠夾在上下兩層濾紙中間,壓緊固定后置于電轉(zhuǎn)槽中,以100 mV恒壓轉(zhuǎn)膜100 min。根據(jù)Marker轉(zhuǎn)膜情況判斷轉(zhuǎn)膜效果。
1.5.3 封閉和抗體孵育 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,吸水紙吸干后,放入相應(yīng)一抗 GOLPH3(1∶1000)、β-actin(1∶1000)、WNT2(1∶200)、β-catenin(1∶1000)稀釋液中,4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10 min,吸水紙吸干后,加入對(duì)應(yīng)二抗(1∶3000),室溫、搖床孵育2 h。
1.5.4 蛋白檢測 于暗室中,將電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)試劑(0.125 ml/cm2)混勻后均勻滴于PVDF膜上,去除多余液體,然后移入X線膠片盒中,曝光30 s~5 min后進(jìn)行顯影,定影。Western blot和熒光信號(hào)強(qiáng)度經(jīng)Image J軟件采集并處理分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量為每種研究蛋白與內(nèi)參蛋白(actin)的比值。
采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
相對(duì)于siNC組,siGOLPH3組細(xì)胞中GOLPH3蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.166±0.069)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.14,P=0.007),表明siRNA轉(zhuǎn)染效果佳。siGOLPH3組細(xì)胞中WNT2蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.480±0.052)低于siNC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.09,P=0.010)。與siNC組相比,siGOLPH3組細(xì)胞增殖率(0.177±0.033)%明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.70,P=0.007)。(圖1、圖2)
圖1 Western blot法檢測GOLPH 3及WNT 2蛋白表達(dá)情況
圖2 EdU實(shí)驗(yàn)檢測siNC組及siGOLPH 3組 U251細(xì)胞的增殖情況(×100)
相對(duì)于siNC組,siWNT2組細(xì)胞中WNT2蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.336±0.056)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.79,P=0.007),表明siRNA轉(zhuǎn)染效果佳。siWNT2組細(xì)胞中β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.596±0.091)低于siNC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.43,P=0.047),表明WNT2對(duì)β-catenin產(chǎn)生影響。siWNT2組細(xì)胞中GOLPH3蛋白相對(duì)表達(dá)量為(1.010±0.052),與siNC組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明WNT2對(duì)GOLPH3蛋白表達(dá)無影響。與siNC組相比,siWNT2組細(xì)胞增殖率(0.676±0.029)%明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.04,P=0.008)。(圖3、圖4)
圖3 Western blot法檢測GOLPH 3、WNT 2及其下游 β-catenin蛋白表達(dá)情況
圖4 EdU實(shí)驗(yàn)檢測siNC組及siWNT 2組 U251細(xì)胞的增殖情況(×100)
相對(duì)于siNC組,siβ-catenin組細(xì)胞中β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.365±0.034)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.60,P=0.003),表明siRNA轉(zhuǎn)染效果佳。與siNC組相比,siβ-catenin組細(xì)胞增殖率(0.557±0.167)%降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.90,P=0.020)。(圖5、圖6)
圖5 Western blot法檢測 β-catenin蛋白表達(dá)情況
圖6 EdU實(shí)驗(yàn)檢測siNC組及 si β-catenin組 U251細(xì)胞的增殖情況(×100)
由于傳統(tǒng)的手術(shù)切除、化療和放療對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果不佳,故膠質(zhì)瘤的基因治療是目前的研究熱點(diǎn)之一。GOLPH3是一個(gè)高度保守的34 kD大小的蛋白[1-2],主要富集于高爾基體囊泡反面的膜外圍,也存在于胞漿池[3]、小管、囊泡、內(nèi)涵體小室以及質(zhì)膜中[4-5]。研究表明,GOLPH3的這種分布對(duì)維持高爾基體的形態(tài)以及囊泡的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)都起著重要作用[6]。Scott等[1]報(bào)道,GOLPH3在肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等多種人類實(shí)體瘤中高表達(dá),而且GOLPH3可以通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)-蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB,又稱AKT)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinm,MTOR)信號(hào)通路影響腫瘤的增殖及對(duì)雷帕霉素的敏感性。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),下調(diào)GOLPH3的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,過表達(dá)GOLPH3則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及對(duì)雷帕霉素的敏感性[1-2,7]。因此提出GOLPH3是一個(gè)全新的致癌基因,而且是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的高爾基體癌基因蛋白[1-2]。此后,相繼有研究報(bào)道GOLPH3在橫紋肌肉瘤及膠質(zhì)瘤中也有高表達(dá)[8-9],進(jìn)一步證實(shí)了GOLPH3在人類實(shí)體瘤中的致癌活性。
遺傳技術(shù)和生物學(xué)技術(shù)分析表明,GOLPH3能促進(jìn)人類腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤細(xì)胞都具有較強(qiáng)的增殖能力,在細(xì)胞周期中,處于分裂期的細(xì)胞增多,而將癌基因敲除后,細(xì)胞分裂減少,細(xì)胞增殖能力下降[10]。Zhou等[11]此前發(fā)現(xiàn)下調(diào)GOLPH3可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的凋亡以及抑制U251細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步研究GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的作用,該研究選用膠質(zhì)瘤U87等細(xì)胞系作為研究對(duì)象,觀察GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖的影響,明確了GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響具有普遍性。研究結(jié)果表明,過表達(dá)GOLPH3可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,下調(diào)GOLPH3可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡[11]。
進(jìn)一步研究表明,GOLPH3在高爾基體分泌泡形成和運(yùn)輸過程中起著重要的作用[12]。GOLPH3與高爾基體反面的基質(zhì)(trans Golgi network,TGN)動(dòng)態(tài)相連,快速從TGN移動(dòng)到細(xì)胞質(zhì),并分布于細(xì)胞內(nèi)分泌泡和細(xì)胞質(zhì)膜[13]。作為TGN蛋白家族的一員,GOLPH3與高爾基體的蛋白質(zhì)加工、分類、包裝與轉(zhuǎn)運(yùn)功能密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì),以囊泡的形式進(jìn)入高爾基體的順面,并經(jīng)加工修飾后,在高爾基體的反面以出芽的方式排出分泌泡,到達(dá)質(zhì)膜后囊泡與質(zhì)膜融合并排出分泌蛋白。應(yīng)用基因敲除技術(shù)減少細(xì)胞內(nèi)GOLPH3的表達(dá)后,從高爾基體順面轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)膜的分泌蛋白或脂質(zhì)明顯減少,而同時(shí)這種遞質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并進(jìn)入高爾基體順面的量并未改變,由此說明GOLPH3在高爾基體分泌泡形成和運(yùn)輸過程中起著重要的作用[14]。
在對(duì)GOLPH3調(diào)節(jié)高爾基體的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究中發(fā)現(xiàn),VPS35能夠與GOLPH3相互作用調(diào)控囊泡運(yùn)輸。VPS35是Retromer復(fù)合體的組成部分,Retromer復(fù)合體由2個(gè)亞基組成,負(fù)責(zé)裝載的亞基由VPS26、VPS29、VPS35組成,調(diào)控細(xì)胞跨膜蛋白從核內(nèi)體到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)[15-18]。應(yīng)用基因敲除技術(shù)敲除VPS35,發(fā)現(xiàn)會(huì)抑制一些跨膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn),例如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、WNT配體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等,并且影響WNT等一些表面受體的功能[19-22]。
WNT是一類分泌型糖蛋白,通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用[23]。WNT信號(hào)通路能引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin積累。β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì),在細(xì)胞連接處與鈣黏素相互作用,參與形成黏合帶,而游離的β-catenin可進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)基因表達(dá),影響細(xì)胞的增殖等[24-25]。WNT/β-catenin信號(hào)通路的激活參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展,其異常表達(dá)、激活及支架蛋白AXIN、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因或β-catenin的突變都會(huì)導(dǎo)致腫瘤的形成[26-29]。WNT信號(hào)通路可概括為:WNT→卷曲蛋白→蓬亂蛋白→β-catenin降解復(fù)合體解散→β-catenin積累進(jìn)入細(xì)胞核→結(jié)合T細(xì)胞因子→激活基因轉(zhuǎn)錄(如c-myc、cyclin D1)[30]。 通 過 這 些 發(fā) 現(xiàn) 可 以 推 斷GOLPH3、VPS35可能是蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的關(guān)鍵分子,通過影響從核內(nèi)體到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)WNT及其下游信號(hào)發(fā)揮一系列的作用。
本研究在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中,用siRNA下調(diào)GOLPH3表達(dá)后,應(yīng)用Western blot法檢測WNT2的表達(dá)。結(jié)果顯示,下調(diào)GOLPH3表達(dá)后,WNT2的表達(dá)受到抑制。應(yīng)用EdU法檢測發(fā)現(xiàn)分別下調(diào)WNT2、β-catenin后,U251細(xì)胞增殖受到抑制,提示GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響有可能通過WNT/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。
文獻(xiàn)表明,VPS35能夠與GOLPH3相互作用調(diào)控囊泡運(yùn)輸[16]。本研究結(jié)果推測,GOLPH3通過WNT/β-catenin信號(hào)通路參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展,可能是通過VPS35介導(dǎo),調(diào)節(jié)WNT在核內(nèi)體和高爾基體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而發(fā)揮作用。為此,下一步將以此為研究內(nèi)容進(jìn)一步深化研究。
本研究期望通過對(duì)GOLPH3及其信號(hào)通路進(jìn)行更加深入的研究,進(jìn)一步揭示GOLPH3調(diào)控膠質(zhì)瘤生長的機(jī)制,為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。此外,也為膠質(zhì)瘤之外的其他腫瘤的分子靶向治療提供重要的參考與理論支持。