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    miR-494在胃癌組織中的表達(dá)及其對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移的影響

    2019-10-17 07:59:24李煒王娟毅姚忠強(qiáng)賀啟華吳光輝
    現(xiàn)代消化及介入診療 2019年9期
    關(guān)鍵詞:空白對照基因組質(zhì)粒

    李煒,王娟毅,姚忠強(qiáng),賀啟華,吳光輝

    胃癌是目前已知的主要消化道惡性腫瘤之一[1]。胃癌早期無明顯臨床癥狀,早期診斷率較低,同時(shí)由于該疾病發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)轉(zhuǎn)移的時(shí)間早,當(dāng)患者被確診時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī),因此胃癌預(yù)后差、病死率較高[2]。近年來研究表明,長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,LncRNA)在調(diào)控癌癥的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[3-4]。miR-494是miRNAs家族中重要的一員,段鴻芳等[5]研究表明:miR-494在肝癌、肺癌、胃腸道腫瘤、腦部腫瘤等疾病中呈現(xiàn)不同的差異表達(dá),并且可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程,從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。李新華等[6]研究表明:miR-494在彌漫型胃癌組織中的表達(dá)下降了4.39倍,在腸型胃癌組織中則下降了2.50倍。目前有較多的miR-494表達(dá)量與胃腸道腫瘤的研究,但miR-494對人胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響的機(jī)制研究較少。本文旨在研究miR-494在胃癌組織中的表達(dá)及其對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移的影響,以期了解miR-494在胃癌組織中的表達(dá)及其對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移作用機(jī)理,從而為胃癌的治療提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 臨床標(biāo)本收集及主要細(xì)胞

    34例胃癌病人腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本均來自2015年6月至2017年8月于我院接受胃癌手術(shù)的患者。人胃癌SGC-7901細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

    1.2 主要試劑與儀器

    TRAIL購自英國Pepro Tech公司;Ki67抗體購自武漢華聯(lián)科有限公司;VEGF、Vimentin抗體購自美國SIGMA公司;N-cadherin、E-cadherin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自廣州威佳科技有限公司;青霉素鈉購自哈藥集團(tuán)制藥總廠;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自賽默飛世爾科技公司;CCK-8 試劑盒購自默沙克有限公司;磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司。

    低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司;光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma公司;蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

    1.3 方法

    1.3.1 分組干預(yù) 將人胃癌SGC-7901細(xì)胞分為三組,分別為空白對照組(Control)、空白質(zhì)粒導(dǎo)入組(miR-NC)和目的基因組(miR-494);其中空白對照組不做任何處理,空白質(zhì)粒導(dǎo)入組導(dǎo)入切除目的基因的質(zhì)粒,目的基因組導(dǎo)入目的基因miR-494。

    1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基中,放入溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞傳三代培養(yǎng)于6孔板中,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法操作,轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3.4 RT-PCR 用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,測定RNA濃度和純度后,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,按照試劑盒操作方法檢測各RNA表達(dá)水平,本實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參。

    1.3.4 CCK-8 檢測細(xì)胞的增殖情況 取上述對數(shù)生長期的細(xì)胞,接種于96個(gè)孔板中細(xì)胞接種,每孔接種1.5×106個(gè)細(xì)胞。放入溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h,待細(xì)胞貼壁后,分別培養(yǎng)0、1、2、3 d后加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)2 h后使用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔的吸光度值,計(jì)算胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率。

    1.3.5 Transwell檢測胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲性及遷移性 使用移液器在Transwell小室的PVPF聚碳酸濾膜外表面均勻涂抹5 μg 纖粘連蛋白,膜內(nèi)側(cè)表面涂5 μg matrigel。調(diào)整對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞至2×105個(gè)/孔,接種于transwell小室,在37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)4 h。建立細(xì)胞侵襲模型,使用PBS清洗三次并去除小室中膜內(nèi)側(cè)表面多余的細(xì)胞,多聚甲醛進(jìn)行固定;400倍顯微視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野,倒置顯微鏡下采用雙盲計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)膜下表面的細(xì)胞數(shù)均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測三次。

    1.3.6 Western blot 檢測蛋白表達(dá)水平 取對數(shù)期細(xì)胞,吸除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基保存于滅菌離心管中。使用1 200 r/min離心10 min后加入裂解液重懸細(xì)胞,置于冰中裂解30 min,再次以1 200 r/min離心10 min,加入200 μL的Loading Buffer 緩沖液,100 ℃煮沸10 min;使用BCA法測定蛋白濃度后,使用SDS-PAGE電泳提取總蛋白,半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后放入TBST溶液中緩慢搖動洗膜5 min,再將 PVDF膜放入配制好的一抗液中孵育,室溫下?lián)u動30 min后放入4 ℃恒溫箱中過夜。取出后使用TBST洗滌三遍后放入二抗反應(yīng)液中室溫孵育2 h;封閉液:二抗為2 000∶1;曝光后以Actin為內(nèi)參蛋白,目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為相對蛋白表達(dá)水平。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    研究數(shù)據(jù)分析和作圖采用的軟件為SPSS 22.0和GraphPda Prism5,方差分析使用單因素方差分析,當(dāng)組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),采用SNK-q方法進(jìn)行進(jìn)一步的比較;使用單因素方差分析時(shí),若P<0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 不同組織中miR-494的表達(dá)水平

    由圖1(A)可以看出,相比癌旁正常組織,胃癌組織miR-494的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);由圖1(B)可以看出,相比空白對照組,空白質(zhì)粒導(dǎo)入組miR-494的表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05);相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組,目的基因組miR-494的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

    2.2 胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

    由圖2(A、B)可以看出,相比空白對照組,空白質(zhì)粒導(dǎo)入組Ki67的表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05);相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組,目的基因組Ki67的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);由圖2(C)可以看出,相比空白對照組,空白質(zhì)粒導(dǎo)入組細(xì)胞抑制率無顯著變化(P>0.05);相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組,目的基因組細(xì)胞抑制率顯著升高(P<0.05)。

    2.3 胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲性檢測結(jié)果

    由圖3可以看出,相比空白對照組,空白質(zhì)粒導(dǎo)入組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目無顯著變化(P>0.05);相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組,目的基因組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.05)。

    圖1不同組織中miR-494的表達(dá)水平 A:癌旁組織和胃癌組織中miR-494的表達(dá)水平;B:miR-494的相對表達(dá)水平。與正常組織相比,**P<0.05

    圖2胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖檢測結(jié)果 A:Ki67蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)印記圖;B:Ki67蛋白質(zhì)相對表達(dá)量;C:細(xì)胞抑制率。與miR-NC組相比,**P<0.05

    圖3胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲性檢測結(jié)果 A:transwell小室檢結(jié)晶紫染色測結(jié)果圖;B:單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目。與miR-NC組相比,**P<0.05

    2.4 蛋白質(zhì)印記檢測相關(guān)蛋白結(jié)果

    由圖4可以看出,相比空白對照組,空白質(zhì)粒導(dǎo)入組Vimentin、VEGF、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05);相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組,目的基因組VEGF、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

    圖4蛋白質(zhì)印記檢測相關(guān)蛋白結(jié)果 A:蛋白質(zhì)印記圖;B:蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。與miR-NC組相比,**P<0.05

    3 討論

    miR-494位于染色體14q32.31上的mi-RNA[7]。目前段鴻芳等[8]研究證明:其表達(dá)水平與肝癌、肺癌、胃腸道腫瘤、腦部腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等密切相關(guān),且在不同的腫瘤組織中表達(dá)不同。本研究發(fā)現(xiàn)相比癌旁正常組織,胃癌組織細(xì)胞中的miR-494表達(dá)水平顯著降低,李新華等[9]研究表明:miR-494在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織中的表達(dá),與本研究得出的結(jié)論相一致。

    增殖細(xì)胞周期相關(guān)核抗原(Ki67)所編碼的基因位于10號染色體上,其分子量為345 kd,是一種細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原,其表達(dá)水平反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)同時(shí)這種基因在維持結(jié)構(gòu)方面起著重要作[10]。馬志君等[11]研究表明:Ki67的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān),是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期重要組成部分。在胃癌SGC-7901細(xì)胞中Ki67的表達(dá)量高說明胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖速度快,反之當(dāng)胃癌SGC-7901細(xì)胞中Ki67表達(dá)量低說明胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn):相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組,目的基因組Ki67的表達(dá)水平顯著降低,說明miR-494的高表達(dá)可以降低Ki67的表達(dá)水平,從而實(shí)現(xiàn)降低胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖。楊慶龍[12]等研究表明,降低Ki67的表達(dá)水平,可以抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖,與本研究得出的結(jié)論相一致。

    細(xì)胞的侵襲和遷移受到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchyml transition,EMT)的調(diào)節(jié)[13]。EMT是指上皮細(xì)胞能暫時(shí)喪失細(xì)胞極性獲得間質(zhì)細(xì)胞移動能力。腫瘤細(xì)胞能夠通過細(xì)胞極性喪失,改變自身細(xì)胞形態(tài)與其他細(xì)胞分離[14-15];N-鈣粘蛋白(N-cadherin,CDH2)也被稱為鈣黏著蛋白-2或神經(jīng)鈣粘著蛋白,是人體由CDH2基因編碼的蛋白質(zhì)。N-鈣粘蛋白是在多種組織中表達(dá)并起到介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞粘附的功能的跨膜蛋白。付麗梅等[16]研究表明:N-cadherin陽性表達(dá)率與癌的浸潤深度、分化程度、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),且隨著癌癥轉(zhuǎn)移的發(fā)生N-cadherin蛋白表達(dá)量會顯著增加。當(dāng)胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖受到抑制時(shí),VEGF表達(dá)則會降低,E-cadherin表達(dá)水平降低、Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平說明胃癌SGC-7901細(xì)胞的EMT過程受到抑制,同時(shí)其黏附能力增強(qiáng),運(yùn)動能力減弱。唐瑩等[17]研究表明:Vimentin是一種間質(zhì)細(xì)胞來源的骨架蛋白,在維持間質(zhì)細(xì)胞的特性中這種蛋白起關(guān)鍵的作用。其研究也表明Vimentin表達(dá)出現(xiàn)異常時(shí),細(xì)胞骨架蛋白的構(gòu)成也會發(fā)生顯著的改變,這種改變會導(dǎo)致正常的上皮細(xì)胞變成纖維狀且易于游動遷移,使得細(xì)胞的侵襲、遷移能力增強(qiáng)。EMT晚期時(shí)Vimentin表達(dá)量通常會顯著強(qiáng)加,這也是EMT晚期的顯著標(biāo)志之一[18-19]。胃癌SGC-7901細(xì)胞中Vimentin高表達(dá)量意味著細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)間的黏附能力降低,癌細(xì)胞的運(yùn)動能力受到抑制。本實(shí)驗(yàn)中可以看出,相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組,目的基因組VEGF、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低,Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高,說明miR-494可以通過調(diào)節(jié)EMT過程使得胃癌SGC-7901細(xì)胞的運(yùn)動能力減弱,同時(shí)N-鈣粘蛋白也表明細(xì)胞質(zhì)間的黏附能力增加,其運(yùn)動能力減弱。韓亮等[20]研究表明:通過抑制細(xì)胞EMT過程及降低相關(guān)蛋白E-cadherin蛋白表達(dá)水平,升高Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平可以有效降低胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖及侵襲能力,與本研究得出的結(jié)論相一致。

    綜上所述,miR-494的表達(dá)可以有效降低胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。其作用機(jī)制可能與抑制相關(guān)增殖蛋白Ki67并調(diào)節(jié)EMT過程有關(guān)。但調(diào)控胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的相關(guān)蛋白及信號通路較多,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討miR-494的表達(dá)通過信號通路的對胃癌SGC-7901的增殖、侵襲及遷移能力影響機(jī)制。

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