單次高劑量放療對小鼠心臟的病理學改變及機制探討

王升曄 封巍 程國平 陳夢圓 陳明

大分割放療如立體定向放射治療（stereotactic body radiotherapy，SBRT）等使腫瘤受到較大生物有效劑量放療時，也增加了臨近及放療區(qū)域內正常器官的放射損傷。胸部腫瘤的大分割放療主要引起心、肺等器官的損傷。胸部放療引起的心臟疾病有很多，包括心肌病變或纖維化、心包炎癥、心臟瓣膜損傷、冠狀動脈事件、心臟傳導問題甚至發(fā)生猝死[1-3]。放射治療的射線能引起一系列炎癥級聯(lián)應激事件，從而導致細胞核等結構的相關損傷。已有的實驗研究表明，心臟受到輻照后，心肌炎癥和內皮細胞損傷以及毛細血管密度減低等可以在心臟功能性損傷前就發(fā)生[4-6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在無癥狀表現(xiàn)的確診有心臟疾病的乳腺癌放療患者中，放療后6個月出現(xiàn)區(qū)域性的心臟灌注缺失。上述研究結果顯示，早期的心臟微血管損傷有導致嚴重心功能損傷的可能性。目前，放療學家們逐漸關注到放療引起的心臟疾病所帶來的風險，而放療相關心臟疾病的發(fā)生機制及與心臟微血管損傷、動脈粥樣硬化等的關系還未明確。本研究旨在探討小鼠心臟受到大分割單次16Gy放療后，其心臟病理學結構改變和可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 由浙江中醫(yī)藥大學提供20只8～10周的SPF級C57BL/6J家系的雄性小鼠，體重約（20±2）g，所有小鼠在同一天入組，采用隨機區(qū)組法被分為對照組1、對照組2，放療組1、放療組2：對照組1、放療組1小鼠入組12周時被處死，對照組2、放療組2小鼠入組30周時被處死。5只小鼠為一組，在溫控約22℃、相對濕度約70%的動物飼養(yǎng)房內分籠飼養(yǎng)，每天進行照明與黑暗交替，每12h更替一次，即20:00～8:00熄燈，用標準的水和食物給予喂養(yǎng)。實驗操作中嚴格遵照浙江中醫(yī)藥大學的動物實驗室相關規(guī)章制度，依照動物倫理學的要求對待所有實驗小鼠。

1.2 實驗試劑 抗體：Anti-CD34(ab81289，上海艾博抗貿易有限公司，免疫組化稀釋比1∶400）；Anti-Von Willebrand Factor（ab9378，上海艾博抗貿易有限公司，免疫組化稀釋比1∶100）。其他輔助試劑：10%的中性福爾馬林緩沖液，蘇木精液，HRP標記的抗兔二抗，pH值為7.4～7.6的磷酸緩沖鹽溶液，pH值為9.0的乙二胺四乙酸修復液。

1.3 方法

1.3.1 放療步驟 清醒狀態(tài)下未行麻醉的實驗小鼠每組5只仰臥位并排于板上，用可調節(jié)夾具固定和限制小鼠的胸部和軀干，并用紙膠進一步將小鼠固定在板上。用單次劑量為16Gy的6MVX線照射放療組小鼠的胸部包括心臟區(qū)域，照射范圍為10.6mm×15mm。為保證小鼠的心臟能夠全部受到輻照，放療區(qū)域將少于1/3的肺組織也包括在內。放療組1、2均在入組第1天完成單次照射。

1.3.2 樣本采集 按實驗設計對入組的小鼠觀察12周和30周，之后對其麻醉并用頸椎脫臼法處死，立即尸解其心臟。將心臟組織在0.1mol/L磷酸緩沖液中漂洗2次，切取小塊心臟組織，大小為1cm3左右，經固定、水洗、脫水、透明、浸蠟包埋等步驟制作標本包埋塊。經石蠟包埋、制作蠟塊并常規(guī)切片，進行HE染色及免疫組化染色檢測。

1.3.3 免疫組化檢測 采用二步法的免疫組化方法。石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液脫水后，用抗原高壓熱修復，加入一抗后在室溫下孵育1h，加入二抗于室溫下30min，3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色，蘇木精液復染后，經過脫水、透明、封片，用顯微鏡觀察。陽性對照按照產品說明書采用已知為陽性表達的組織，陰性對照用磷酸緩沖鹽溶液替代。

1.3.4 微血管密度（microvascular density，MVD）計算方法 參照Weidner的計算方法[7]，首先在低倍鏡視野下（×100倍）選擇MVD最高的3個熱點視野，然后在高倍鏡下（×100倍）計數(shù)3個視野內的微血管數(shù)量，取3者的平均值作為一個心臟標本的MVD值。無論管腔存在與否，單個陽性染色細胞或細胞團均可作為一個微血管，而管腔截面比8個紅細胞大的血管則不能算為微血管。經CD34+或vWF標記的免疫組化染色后組織切片也行MVD計數(shù)，此時將棕黃染色的內皮細胞或內皮細胞簇作為一條微血管。

1.3.5 心外膜厚度的測量 取每只小鼠左心室壁（包括壁膜間隔成分）的心臟組織，經包埋蠟塊、切片及HE染色后，在低倍鏡下（×100倍）選取每個心臟標本心外膜的不同部位，然后在高倍鏡下（×400倍）對每個心臟標本行12次外膜厚度測量，計算平均值作為該心臟標本的心外膜厚度。每組小鼠再取平均值作為該組的心外膜厚度。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 放療結果 放療組2中的1只小鼠在放療后29周4天時發(fā)生猝死。其余小鼠在規(guī)定的相應時間被處死。

2.2 12周時兩組小鼠心臟MVD計數(shù)比較 見圖1-3、表 1。

表1 12周時兩組小鼠心臟MVD計數(shù)比較

由圖1-3和表1可見，小鼠經單次大分割放療后12周時，心外膜和心肌上的巨噬細胞含鐵血黃素有所增加，彈性纖維被破壞，呈現(xiàn)為雜亂無序，并可見腫脹的內皮細胞和橫紋肌細胞。放療組1小鼠心臟HE染色下MVD較對照組1明顯減少（P＜0.01）；CD34+和vWF標記的MVD明顯增加（均P＜0.01）。

2.3 30周時兩組小鼠心臟MVD計數(shù)比較 見圖4-6、表 2。

由圖4-6和表2可見，小鼠經單次大分割放療后30周時，心外膜和心肌上的巨噬細胞及其含鐵血黃素有進一步的增加，更多的彈性纖維被破壞甚至斷裂，雜亂無序的表象更為明顯，腫脹的內皮細胞和橫紋肌細胞在鏡下隨處可見。放療組2小鼠心臟HE染色下MVD較對照組2明顯減少（P＜0.01）；CD34+和vWF標記的MVD明顯增加（均P＜0.01）。

2.4 12周和30周時兩組小鼠心外膜厚度比較 12周時放療組1小鼠心外膜厚度為20.6μm，對照組1為 9.4μm；30周時放療組2小鼠心外膜厚度為22.2μm，對照組2為10.2μm。隨著時間的延長，放療組2心外膜較對照組2明顯增厚，見圖7。

圖 1 12 周時小鼠心肌組織 HE 染色圖（A：對照組 1，×100；B：對照組 1，×400；C：放療組 1，×100；D：放療組 1，×400）

圖2 12周時小鼠心肌組織CD34+標記的免疫組化染色圖（A：對照組 1，×400；B：放療組 1，×400）

圖3 12周時小鼠心肌組織vWF標記的免疫組化染色圖（A：對照組1，×400；B：放療組 1，×400）

表2 30周時兩組小鼠心臟MVD計數(shù)比較

圖 4 30 周時小鼠心肌組織 HE 染色圖（A：對照組 2，×100；B：對照組 2，×400；C：放療組 2，×100；D：放療組 2，×400）

圖5 30周時小鼠心肌組織CD34+標記的免疫組化染色圖（A：對照組 2，×400；B：放療組 2，×400）

圖6 30周時小鼠心肌組織vWF標記的免疫組化染色圖（A：對照組2，×400；B：放療組 2，×400）

圖7 30周時小鼠心外膜染色圖（A：放療組2；B：對照組2；HE染色，×400，箭頭示心外膜）

3 討論

近年來，放療學家們對于放療所造成的細胞毒 性及其輻射損傷日益關注。輻射損傷造成小鼠相關臟器組織的病理生理學改變的研究也時有報道。心臟作為對輻射較為敏感的靶器官，其大體結構和微血管結構存在著放射劑量和時間上的相關性和依賴性。大分割劑量的放療可能造成較嚴重的心臟損傷，且可能放療后早期就發(fā)生，損傷隨著時間的推移而進展。從放療后12周和30周處死的小鼠心臟標本來看，放療組小鼠的心外膜較對照組顯著增厚；提示放療組小鼠心臟纖維廣泛增厚。接受單次16Gy胸部放療的小鼠在放療后早期，即12周時，內皮細胞的丟失大于細胞的增殖，MVD呈下降趨勢，30周時MVD出現(xiàn)進一步下降。

CD34+分子是一種黏附分子，屬于鈣黏蛋白家族。它可以在哺乳動物包括人類的造血祖或干細胞的表面有選擇地表達。它以受體-配體相結合的方式起作用，是參與細胞間信號遞呈、免疫應答、炎癥發(fā)生和凝血反應等多個病理生理過程的主要分子[8]。血管性假血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）由血管巨核細胞及內皮細胞生成和分泌，參與止血過程。缺乏vWF可造成血管性假血友病。在內皮細胞受到損傷或刺激時，血漿vWF的數(shù)量出現(xiàn)增高[9]。當出現(xiàn)持續(xù)進展的血管滲漏，微血管結構受到損害，CD34+和vWF的表達增多，提示內皮細胞受損[10-12]。多個研究認為，受到劑量較高的放療時心臟組織中能發(fā)現(xiàn)心肌白蛋白沉積，這與淀粉樣變性相關，提示血管的滲漏[13-14]。淀粉樣變性由異常原纖維或胞外不溶性物沉積而成，也可能由錯誤折疊的蛋白質匯聚形成，其重要的臨床特點是會導致心臟衰竭[15]，由此我們推斷這可能是導致個別小鼠在隨訪后期出現(xiàn)猝死的潛在原因。

多個研究提示，盡管經輻射后小鼠的血管結構和功能已經受到了較大程度的損傷，但其心功能的改變在早期是較小的，并不是進展性的。由此推斷小鼠心肌的重組、重構在一定程度上可能代償了部分血管結構改變和功能損傷[16]。個別小鼠在放療后不到30周時死亡，最可靠的方法是可以用尸檢來明確其真正死因。除了之前提及的淀粉樣變是可能的原因外，另一個可能原因是心肌的這種代償機制在較高劑量輻照下并非能較長時期保持。離體的實驗結果提示，受到早期炎癥反應激發(fā)后，心肌細胞相應發(fā)出明顯信號[17]，該過程可直接產生大量的巨噬細胞。心肌細胞與巨噬細胞之間的這種相互反應，使心肌收縮力出現(xiàn)下降從而使心臟舒張期和收縮期的充盈程度均下降。心肌收縮力的減退可以用心肌細胞減少和膠原黏著增加來部分解釋[18]。內質網膜上的Ca2+-ATP酶可以代償損傷心肌的部分功能，以盡可能保持正常的舒張和收縮能力。

本研究提示小鼠心臟接受單次16Gy放療后，觀察12周和30周后處死，放療組小鼠心外膜較對照組有明顯增厚；MVD逐漸下降，提示內皮細胞的減少，同時用CD34+和vWF標記的MVD逐漸增加，也相應提示內皮細胞損傷。限制性心包炎可以造成炎癥細胞和含鐵巨噬細胞的增多，常常伴有心外膜增厚；這種限制性的心肌重塑可能造成舒張期和收縮期心臟大血管和心肌表面的淀粉樣變沉積，從而可能加重血管滲漏。這個機制或許能部分解釋小鼠猝死的原因。

本研究是對單次大分割放療后的小鼠心臟的病理學研究，因樣本量和實驗條件的限制，僅對其病理改變行HE、免疫組化等較基本的病理學研究，為人體心臟放射損傷的機制提供了部分依據。未來的研究可以建立高血壓或者動脈粥樣硬化的小鼠模型，并對其心臟進行不同放療分割劑量的照射，來進一步觀察建模小鼠在不同放療分割劑量下的心臟病理改變。