微量元素鋅對牛卵母細(xì)胞體外成熟及其體外受精胚胎發(fā)育的影響

俸 云，趙 鑫，阮子蕓，沈朋雷，石德順，陸鳳花

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004）

卵母細(xì)胞體外成熟（in vitroMaturation，IVM）可以為動物克隆、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)提供充足的卵源，盡管人們對卵母細(xì)胞的體外成熟體系進(jìn)行了大量研究，但卵母細(xì)胞的體外成熟效率仍然顯著低于體內(nèi)成熟。由于培養(yǎng)環(huán)境中氧含量存在差異，體外成熟的卵母細(xì)胞會承受更高的氧壓，從而導(dǎo)致活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）過量產(chǎn)生。當(dāng)ROS 的產(chǎn)生速度超過其清除速度時會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞生物大分子的正常結(jié)構(gòu)，從而對體外成熟效率產(chǎn)生影響。

目前研究在體外成熟過程中普遍采用添加抗氧化劑來清除過量ROS。研究表明，通過使用褪黑素[1]、白藜蘆醇[2]等抗氧化物質(zhì)可以降低卵母細(xì)胞中的ROS 含量，提高后續(xù)胚胎的發(fā)育效率。鋅作為哺乳動物必需的微量元素，在配子生成、胎兒發(fā)育等生理過程中起關(guān)鍵作用[3]。同時，鋅還具有抗氧化功能。有研究表明，在培養(yǎng)液中補(bǔ)充適量的鋅可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的危害[4]。

盡管鋅在哺乳動物正常生理活動的調(diào)控過程中起到了關(guān)鍵作用，但其在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中發(fā)揮的作用尚不明確。本研究以牛卵母細(xì)胞為研究對象，通過在體外成熟過程中添加不同濃度的硫酸鋅初步探究其對牛卵母細(xì)胞體外成熟和抗氧化作用的影響，為提高牛卵母細(xì)胞IVM 效率提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 牛卵巢購自南寧市肉聯(lián)廠屠宰場。卵巢在離體后迅速保存于37℃左右經(jīng)高壓滅菌的生理鹽水中，并在4 h 內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室；牛冷凍精液（麥管冷凍，250 μL/管）購買自南寧市品改站；卵泡液樣本取自直徑為2～6 mm 的健康牛卵泡，血液樣本采集自體況健康的成年雌性牛頸靜脈。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 除特殊說明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均購自美國Sigma-Aldrich 公司。TCM199 粉末和胎牛血清購自美國Gibco 公司，TRIzol Reagent 購自美國Invitrogen 公司，微量反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購自美國Ambion 和Invitrogen 公司；實(shí)時熒光定量PCR 試劑購自日本TaKaRa 公司；本試驗(yàn)所用液體由三蒸水配制，經(jīng)0.22 μm 過濾器過濾滅菌后使用。

體視顯微鏡和熒光倒置顯微鏡購買自日本Nikon 公司；實(shí)時熒光定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems公司；超凈工作臺購自蘇州佳德凈化科技公司；培養(yǎng)箱和培養(yǎng)耗材購自美國Thermo Fisher 公司。

1.3 牛卵泡液、頸靜脈血清和體外成熟液中鋅含量的測定 分別收集健康牛的卵泡液和頸靜脈血液各5 個樣品，經(jīng)12 000 r/min 離心10 min 后，取上清并使用0.22 μm過濾器過濾后，保存于-20℃冰箱中。培養(yǎng)液樣本選取本實(shí)驗(yàn)室所使用的卵母細(xì)胞體外成熟液（9.5 g/L TCM 199+2.2 g/L NaHCO3+0.11 g/L 丙酮酸鈉+1.2 g/L Hepes+0.009 g/L EDTA+0.06 g/L 青霉素+0.1 g/L 鏈霉素）。所有樣本采集完畢后，盡快送至廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICPMS，美國）對樣品中的鋅元素含量進(jìn)行檢測。

1.4 牛卵母細(xì)胞的收集和體外成熟 牛卵巢經(jīng)消毒清洗后，使用帶有12 號針頭的注射器抽取直徑為2～6 mm 的卵泡內(nèi)容物。在體視顯微鏡下挑選胞質(zhì)完整均勻、具有完整卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-Oocyte Complex，COCs），依次使用洗卵液（CCM：9.5 g/L TCM 199+0.9 g/L NaCl+1.2 g/L Hepes+0.06 g/L 青霉素+0.1 g/L 鏈霉素+0.4 g/L NaHCO3+2% 胎牛血清）、體外成熟液清洗后，移入含有不同濃度硫酸鋅（0、0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL）的體外成熟液中，置于38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟，24 h 后統(tǒng)計(jì)第一極體排出率。

1.5 牛卵母細(xì)胞的體外受精和胚胎體外培養(yǎng) 牛卵母細(xì)胞經(jīng)24 h 的體外成熟后，使用移液槍輕輕吹打COCs使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離，選取胞質(zhì)均勻且排出第一極體的卵母細(xì)胞，移入由受精液（F 液：TALP 基礎(chǔ)液+0.6%牛血清白蛋白+50 mg/L 肝素+2.5 mmol/L 咖啡因）制成的微滴中（每滴25 μL），用石蠟油覆蓋，每滴15個卵母細(xì)胞。37.5℃水浴解凍牛冷凍精液，將鏡檢合格的精液轉(zhuǎn)移至含2 mL F 液的圓管底部，置于培養(yǎng)箱中上游30 min，完成精子獲能。接著吸取上清，1 500 r/min離心5 min 后，棄上清，將約5 μL 高活力精子均勻加入到含有成熟卵母細(xì)胞的微滴中，調(diào)整密度為5×106個/mL左右，隨后置于38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中共孵育。

體外受精24 h 后，使用移液槍輕輕吹去黏附在合子表面的精子，使用胚胎培養(yǎng)液（CM：9.5 g/L TCM199+2.2 g/L NaHCO3+1.19 g/L Hepes+0.06 g/L 青霉素+0.1 g/L鏈霉素+3% 胎牛血清）清洗1 次后，移入由CM 制成的微滴中（每滴25 μL），并用石蠟油覆蓋，每滴15個早期胚胎，并置于38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。隔天換液，并于受精完成后的24 h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，144 h 后統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.6 缺鋅處理 參考前人的實(shí)驗(yàn)方法[5]對體外成熟液進(jìn)行缺鋅處理。使用10 μmol/L 鋅螯合劑N，N，N'，N'-tetrakis-（2-pyridylmethyl）-ethylenediamine（TPEN）來誘導(dǎo)缺鋅。將卵母細(xì)胞分為3 組：①常規(guī)體外成熟設(shè)為對照組；②10 μmol/L TPEN 處理；③10 μmol/L TPEN+10 μmol/L 硫酸鋅處理。隨后，通過使用10 μmol/L TPEN 處理不同時間（0、3、5、7 h）以檢測缺鋅時間對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響。

1.7 卵母細(xì)胞cDNA 的合成 使用無Ca2+、Mg2+的PBS將體外成熟后的卵母細(xì)胞清洗3 次后，移入10 μL cell lysis Buffer 中裂解，每組20 個卵母細(xì)胞；置于PCR 儀中75℃孵育15 min 以滅活RNA 酶并釋放出卵母細(xì)胞中的基因組；之后加入1 μL DNase I 和10 μL 的10×reaction Buffer，37℃孵育30 min，用以消化基因組DNA；再加入1 μL EDTA，2 μL Random Primer，1 μL dNTP，65℃孵育10 min以滅活DNase I；最后加入10 IU Recombinant Rnase inhibitor，4 μL 5×First-Strand Buffer，2 μL dithiothreitol 和0.25 μL的SuperScripTM ⅡRT 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)程序：25℃，5 min；42℃，90 min；95℃，5 min；4℃，終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)所得cDNA 保存于-20℃冰箱中備用。

1.8 總RNA 提取和cDNA 第1 鏈的合成 應(yīng)用TRIzol法提取卵丘細(xì)胞的總RNA，對純度和完整性符合要求的RNA 立刻進(jìn)行cDNA 第1 鏈合成。反應(yīng)體系：混合2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser 和2 000 ng RNA 模板，再加入RNA-free H2O 補(bǔ)足 10 μL，置于PCR儀中42℃孵育2 min；隨后向上一步的混合液中加入4 μL 5×Primerscript Buffer，1 μL Primerscript Enzyme Mix，1 μL RT Primer Mix，最后加入RNA-free H2O；反應(yīng)程序：37℃，15 min；85℃，5 s。所得cDNA 存于-20℃冰箱中備用。

1.9 卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的檢測 使用2'，7'-Dichloroflu orescin diacetate（DCHFDA）對體外成熟后卵母細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平進(jìn)行檢測，每組30 個卵母細(xì)胞。使用PBS將卵母細(xì)胞清洗3 次后，將卵母細(xì)胞移入含有10 μmol/L DCHFDA 的PBS 中，38.5℃避光孵育15 min，接著使用PBS 清洗3 次后置于熒光顯微鏡下觀察并使用軟件Image J 對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.10 實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR） 根據(jù)NCBI 上已公布的引物序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物見表1。分別以卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞的cDNA 為模板，β-actin為內(nèi)參，使用相對定量的方法對基因表達(dá)的情況進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，ROX Ⅱ 0.4 μL，上、下游引物（10 nmol/L）各0.3 μL，模 板cDNA 1 μL，RNA-free H2O 8 μL。反應(yīng)程序：95℃，10 min；95℃，30 s；55℃，1 min，共40 個循環(huán)。每次檢測重復(fù)3 次，并根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)差異。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，并應(yīng)用SPSS 17.0 軟件，使用單因素方差分析中的Tukey 檢驗(yàn)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

表1 RT-qPCR 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 牛卵泡液、頸靜脈血清和IVM 液中的鋅元素含量表2 結(jié)果表明，體外成熟液中鋅元素顯著低于牛卵泡液和頸靜脈血清。

表2 鋅元素含量的檢測 μg/mL

2.2 缺鋅對卵母細(xì)胞體外成熟的影響 表3 結(jié)果表明，使用鋅螯合劑TPEN 去除體外成熟液中的鋅元素后，卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著下降，而補(bǔ)充10 μmol/L 硫酸鋅后有所回升。表4 結(jié)果表明，缺鋅時間超過5 h，卵母細(xì)胞的第一極體排出率顯著下降，且具有時間依賴性。

表3 缺鋅對卵母細(xì)胞體外成熟的影響

表4 缺鋅時間對卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2.3 不同濃度硫酸鋅對卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)發(fā)育的影響 表5 結(jié)果表明，各處理卵母細(xì)胞第一極體排出率無顯著差異。表6 結(jié)果表明，對添加硫酸鋅成熟后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，各組間卵裂率無顯著差異；但與對照組相比，添加濃度為0.8 μg/mL 組的囊胚率顯著提高。

表5 不同濃度硫酸鋅對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

表6 不同濃度鋅對牛胚胎體外發(fā)育的影響

2.4 鋅對成熟后卵母細(xì)胞中ROS 含量的影響 圖1 表明，與對照組相比，在體外成熟過程中添加0.8 μg/mL硫酸鋅可以下調(diào)卵母細(xì)胞中ROS 水平（P＜0.05）。

2.5 鋅對相關(guān)基因表達(dá)的影響 圖2 結(jié)果表明，與對照組相比，添加0.8 μg/mL 硫酸鋅提高了成熟后的牛卵母細(xì)胞中抗氧化酶相關(guān)基因SOD1、CAT、TXN1和PRD1的mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05）。圖3 結(jié)果表明，與對照組相比，0.8 μg/mL 硫酸鋅組卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因PTX3和TSG6mRNA 的表達(dá)水平提高（P＜0.05），HAS2mRNA 的表達(dá)水平有所提高但差異不顯著。

圖1 添加0.8 μg/mL 硫酸鋅成熟后的牛卵母細(xì)胞ROS 水平

圖2 添加0.8 μg/mL 硫酸鋅成熟后的牛卵母細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)變化

圖3 添加0.8 μg/mL 硫酸鋅成熟后的牛卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展基因的表達(dá)變化

3 討 論

作為哺乳動物必需的微量元素之一，鋅可以與蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等相互作用，對機(jī)體正常的生理活動產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，體外成熟液中的鋅元素含量顯著低于體液，這很可能會對卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎的發(fā)育產(chǎn)生影響。

為確定鋅元素是否會對牛卵母細(xì)胞的IVM 產(chǎn)生影響，本研究使用鋅螯合劑TPEN 去除體外成熟液中的鋅元素后進(jìn)行體外成熟，發(fā)現(xiàn)牛卵母細(xì)胞的體外成熟效率顯著下降，且具有時間依賴性，而補(bǔ)充適量的硫酸鋅后成熟效率則出現(xiàn)了部分回升。這表明鋅參與了牛卵母細(xì)胞的體外成熟。有研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚卵泡液中鋅元素含量會隨著卵母細(xì)胞的生長而升高，并在排卵時達(dá)到最高[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，鋅在排卵前和排卵期會影響卵母細(xì)胞的成熟和顆粒細(xì)胞的功能，缺鋅會導(dǎo)致卵丘細(xì)胞分化、擴(kuò)張和卵泡破裂異常，并對卵母細(xì)胞體外和體內(nèi)的發(fā)育產(chǎn)生不良影響[7]。這些研究均表明，鋅在卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮了重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，極微量的鋅就能夠參與調(diào)控豬卵母細(xì)胞的第1 次減數(shù)分裂，保證卵母細(xì)胞完成核成熟[8]。而在本研究中，在體外成熟液中添加不同濃度硫酸鋅（0、0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL）的各組間卵母細(xì)胞的第一極體排出率并無顯著差異。由于卵母細(xì)胞中儲存了大量的蛋白質(zhì)、mRNA 和各種早期胚胎發(fā)育必需的微量元素，所以推測本實(shí)驗(yàn)中各組卵母細(xì)胞第一極體排出率無顯著差異的主要原因很可能是牛卵母細(xì)胞中已經(jīng)儲存的鋅足夠用來調(diào)控減數(shù)第1 次分裂。為進(jìn)一步探討不同濃度硫酸鋅對牛卵母細(xì)胞IVM 質(zhì)量的影響，本研究對添加不同濃度的硫酸鋅成熟后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精并統(tǒng)計(jì)早期胚胎的發(fā)育能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，各組胚胎卵裂率無顯著差異，但添加0.8 μg/mL 硫酸鋅組的囊胚率顯著提高。這表明在體外成熟過程中添加適量的鋅元素能夠提高卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量。另外，有研究報(bào)道，添加0.5 μg/mL和1.0 μg/mL 硫酸鋅能顯著提高牦牛早期胚胎的卵裂率，而添加2.0 μg/mL 硫酸鋅則能使牦牛的囊胚率顯著提高[9]。本研究的結(jié)果與前人的研究結(jié)果存在差異，推測與卵母細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境以及物種差異有關(guān)。

作為抗氧化酶的組成成份之一，鋅元素含量很可能會對卵母細(xì)胞的氧化還原水平產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，添加0.8 μg/mL 硫酸鋅后進(jìn)行體外成熟，卵母細(xì)胞中ROS 含量顯著降低。由于ROS 在卵母細(xì)胞成熟過程中可以通過改變氧化還原途徑而導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡及胚胎死亡[10]，推測在體外成熟液中添加適宜濃度硫酸鋅能降低ROS 含量，減少凋亡，促進(jìn)成熟質(zhì)量，進(jìn)而顯著提高牛體外受精胚胎的囊胚率。

抗氧化酶是動物機(jī)體內(nèi)重要的代謝酶，可以去除超氧化物自由基并減少細(xì)胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，缺鋅會導(dǎo)致抗氧化酶Cu/Zn-SOD 活性位點(diǎn)的三級結(jié)構(gòu)被擾亂，抗氧化能力減弱，從而誘發(fā)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激[11]，而氧化應(yīng)激又是參與誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的一個主要機(jī)制[12]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過0.8 μg/mL 硫酸鋅處理后，卵母細(xì)胞中抗氧化酶基因SOD1、CAT、TXN1和PRD1的表達(dá)水平顯著提高，這表明在IVM 過程中添加硫酸鋅增強(qiáng)了卵母細(xì)胞的抗氧化能力。有研究也發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元細(xì)胞的體外培養(yǎng)基中添加鋅可以提高神經(jīng)元細(xì)胞中抗氧化酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育，并提高細(xì)胞的存活率[13]。

另外，作為在卵母細(xì)胞成熟過程中的關(guān)鍵因素之一，卵丘細(xì)胞也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展程度能夠?qū)β涯讣?xì)胞的發(fā)育能力產(chǎn)生影響，從而影響卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量[14]。目前學(xué)界普遍將卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展水平視為評判卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量的指標(biāo)之一[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外成熟過程中添加硫酸鋅后卵丘細(xì)胞擴(kuò)展基因PTX3、TSG6的mRNA 的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)，提高了卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在牛卵母體外成熟過程中添加0.8 μg/mL硫酸鋅可以提高卵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶基因和卵丘擴(kuò)展基因的表達(dá)水平，降低卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，從而提高卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量和體外受精胚胎的發(fā)育效率。