牛至油和過(guò)瘤胃蛋氨酸組合添加對(duì)奶牛瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量與養(yǎng)分消化率的影響

丁大偉，滕樂(lè)幫，高許雷，呂永艷，孫國(guó)強(qiáng)*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.平度市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266700；3.青島市嶗山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266061）

牛至油（Oo）又名牛至香酚、皮薩草、香芹酚等，是由天然植物牛至中提取的揮發(fā)油，亦可人工合成，主要成分是百里香酚、香芹酚等酚類化合物，具有廣泛的抑菌殺菌效果[1]。徐方華等[2]利用人工瘤胃進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)添加Oo 可以降低瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮（NH3-N）濃度。林波等[3]在湖羊飼糧中添加Oo 及其主要成分后發(fā)現(xiàn)提高了粗蛋白質(zhì)（CP）的過(guò)瘤胃率。蛋氨酸（Met）不僅是反芻動(dòng)物的主要限制性氨基酸之一[4]，并且是瘤胃內(nèi)部分微生物的主要限制性氨基酸[5]。王劍飛等[6]在體外發(fā)酵試驗(yàn)中分別添加過(guò)瘤胃蛋氨酸（RPMet）與Met 后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中原蟲蛋白均顯著提高。本課題組前期分別對(duì)Oo[7]和RPMet[8]進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)奶牛瘤胃微生物蛋白（MCP）產(chǎn)量和飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率均有促進(jìn)作用，并確定了Oo 和RPMet 的最適添加量。但目前關(guān)于Oo 和RPMet 聯(lián)合使用對(duì)奶牛瘤胃MCP 產(chǎn)量和消化率的影響鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)擬在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探究Oo 和RPMet 聯(lián)合使用對(duì)奶牛瘤胃MCP 產(chǎn)量和養(yǎng)分表觀消化率的影響，以期找到提高瘤胃MCP產(chǎn)量和表觀消化率的最佳組合，為Oo 和MCP 在實(shí)際生產(chǎn)上聯(lián)合使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)選用煙臺(tái)荷牧園牧業(yè)有限責(zé)任公司4～5歲、體重（640±25）kg、2～3 胎、產(chǎn)奶量（37.1±0.3）kg、乳成分及泌乳期（90±15）d 的荷斯坦奶牛40 頭，隨機(jī)分為10 個(gè)組，每組4 頭，對(duì)照組（C）飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組補(bǔ)飼不同水平的Oo 和RPMet，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。每頭奶牛每天預(yù)留0.5 kg 精料作為載體與Oo 和RPMet 混合后隨全混合日糧（TMR）一起飼喂，試驗(yàn)期為75 d（預(yù)試期15 d，正試期60 d）。預(yù)試期開(kāi)始時(shí)間為2018 年5 月5 日。試驗(yàn)所用的Oo 和RPMet 均購(gòu)自青島潤(rùn)博特生物科技有限公司，其中Oo 為白色粉末狀物質(zhì)，其組成為Oo、二氧化硅和淀粉等，Oo 含量≥10%，水分≤12%；RPMet 為白色顆粒狀物質(zhì)（過(guò)瘤胃率為85%），其組成為DL-蛋氨酸、二氧化硅等，DL-蛋氨酸≥60%，水分≤12%。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) g/（d·頭）

1.2 飼養(yǎng)管理 采用荷蘭進(jìn)口SAC 全自動(dòng)擠奶器擠奶3 次（04:00、12:00、18:00），擠奶后30 min 內(nèi)投喂TMR 料。試驗(yàn)牛按照常規(guī)規(guī)程進(jìn)行管理。TMR 組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

1.3 試驗(yàn)樣品的采集與處理

1.3.1 TMR 樣與糞樣的采集與處理 在預(yù)試期第1～3 天，正試期第28～30、58～60 天采集TMR 樣與每頭試驗(yàn)牛的糞樣，TMR 樣采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣。糞樣采用全收糞法進(jìn)行收集，采樣時(shí)提前將牛床沖洗干凈，試驗(yàn)牛排便后及時(shí)對(duì)糞便進(jìn)行收集，將當(dāng)天收集的糞樣混合均勻并稱重，糞樣加10%硫酸進(jìn)行固氮處理后-20℃冷凍保存，將3 d 內(nèi)收集糞樣的比例混合糞樣，四分法進(jìn)行縮樣。收集的TMR 樣與糞樣65℃烘干后粉碎。

1.3.2 尿樣的采集與處理 在預(yù)試期的第1～3 天，正試期的第28～30、58～60 天，參考朱雯[9]及張凱祥等[7]收尿方法采集每頭試驗(yàn)牛的尿樣，尿樣加入10%的H2SO4調(diào)整尿液的pH（pH＜3），-20℃保存。

1.3.3 主要養(yǎng)分表觀消化率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[10]對(duì)TMR 與糞中的干物質(zhì)（DM）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、CP、鈣（Ca）、磷（P）進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算養(yǎng)分表觀消化率。

1.3.4 瘤胃MCP 產(chǎn)量 通過(guò)尿中嘌呤衍生物（PD）對(duì)瘤胃MCP 產(chǎn)量進(jìn)行估測(cè)[11]。PD 為尿酸與尿囊素的含量之和。用分光光度計(jì)測(cè)定尿酸（型號(hào)UV-1800 PC），酶標(biāo)分析儀測(cè)定尿囊素（型號(hào)DNM-9602）。

表2 TMR 組成和營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

其中，X為小腸吸收外源性嘌呤數(shù)量（mmol/d）；0.85為腸道吸收的嘌呤轉(zhuǎn)化為尿中PD 的回收率；0.385BW0.75為內(nèi)源嘌呤衍生物的數(shù)量。

瘤胃MCP 產(chǎn)量的計(jì)算公式[12]：

其中，6.25 為氮與蛋白質(zhì)的換算系數(shù)；X為小腸吸收外源性嘌呤數(shù)量（mmol/d）；70 為每毫摩爾嘌呤的含氮量（mg/mmol）；0.83 為微生物核酸嘌呤的消化率；0.116 為瘤胃微生物總氮中嘌呤氮的比例。以正試期第28～30、58～60 天瘤胃MCP 產(chǎn)量的平均值作為正試期內(nèi)瘤胃MCP 產(chǎn)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010 軟件進(jìn)行預(yù)處理。SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan′ 法進(jìn)行多重比較，以P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Oo 與RPMet 的不同添加量組合對(duì)奶牛瘤胃MCP 產(chǎn)量的影響 由表3 可以看出，與對(duì)照組相比，ML、LM、HM、LH、MH 組MCP 產(chǎn)量分別提高了13.66%、12.81%、12.28%、12.96%、13.73%（P＜0.05）。MH、ML 組PD 排出量極顯著提高，LM、LH、HM、HL、HH、LL 組顯著提高。MH 組尿酸顯著提高；ML、MH、LH、HM、LM、HL、HH 組的尿囊素顯著提高。

2.2 Oo 與RPMet 的不同添加量組合對(duì)奶牛飼糧主要養(yǎng)分表觀消化率的影響 由表4 可以看出，與對(duì)照組相比，MH、HM 組CP 消化率極顯著提高，MM、LM、HH顯著提高。HH、MH 組NDF 消化率顯著提高；HH、MH 組ADF 消化率極顯著提高，HL、LL 組顯著提高；MH 組DM 消化率顯著提高。

3 討 論

3.1 Oo 與RPMet 的不同添加量組合對(duì)奶牛瘤胃MCP 產(chǎn)量的影響 本試驗(yàn)通過(guò)PD 對(duì)瘤胃MCP 進(jìn)行了間接測(cè)定[11]。張凱祥等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加Oo 后奶牛的瘤胃MCP 產(chǎn)量顯著增加。有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加RPMet 可以增加反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)纖維分解菌等微生物數(shù)量[6,13]。Oo 對(duì)瘤胃內(nèi)不同微生物菌群具有不同的抑制效果，如Oo 對(duì)于瘤胃內(nèi)的超級(jí)產(chǎn)氨菌[14]以及甲烷菌[2]具有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)于瘤胃內(nèi)的真菌抑制作用較弱[3]。抑制超級(jí)產(chǎn)氨菌可以減緩瘤胃內(nèi)NH3-N 的產(chǎn)生速率以及濃度，這可能改變了瘤胃內(nèi)能氮釋放的相對(duì)速率以及能氮平衡促進(jìn)了瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖[15]。Oo在抑制甲烷菌降低瘤胃內(nèi)甲烷生成的同時(shí)，總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）升高，丙酸、丁酸比例升高[16]，這可能是Oo 抑制甲烷菌后使得丙酸菌等在氫的競(jìng)爭(zhēng)中取得優(yōu)勢(shì)從而增加了丙酸的生成[17]。Met 是瘤胃內(nèi)微生物的主要限制性氨基酸之一[5]，因?yàn)镽PMet 的過(guò)瘤胃率并非百分之百，溢出的Met 會(huì)刺激瘤胃內(nèi)微生物的生長(zhǎng)繁殖[13]。試驗(yàn)中除MM 組外大體呈現(xiàn)出Oo 中間添加量依次優(yōu)于低添加量組優(yōu)于高添加量組的趨勢(shì)，而RPMet未有明顯規(guī)律。LL 組MCP 產(chǎn)量較低可能是因?yàn)樘砑恿枯^低而對(duì)瘤胃內(nèi)微生物影響較小。目前關(guān)于Oo 與Met對(duì)瘤胃微生物的研究多為體外發(fā)酵試驗(yàn)。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組瘤胃MCP 產(chǎn)量提高與上述試驗(yàn)的結(jié)果一致，說(shuō)明Oo與RPMet 聯(lián)合使用對(duì)奶牛瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖具有促進(jìn)作用。

表3 添加不同水平組合Oo 和RPMet 對(duì)奶牛瘤胃MCP 產(chǎn)量的影響

表4 添加不同水平組合Oo 和RPMet 對(duì)奶養(yǎng)分表觀消化率的影響 %

3.2 Oo 與RPMet 的不同添加量組合對(duì)奶牛飼糧主要養(yǎng)分表觀消化率的影響 白烏日汗[16]在體外發(fā)酵系統(tǒng)中添加450 mg/L Oo 時(shí)發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中的DM 降解率顯著提高。王娟等[18]利用綿羊研究發(fā)現(xiàn)添加4 g/（d·頭）Oo時(shí)可以顯著提高青貯玉米的NDF 降解率。羅雄等[19]在西門塔爾牛飼糧中添加250 g/（d·頭）RPMet 后發(fā)現(xiàn)飼糧的DM、NDF 和ADF 消化率顯著提高。本試驗(yàn)與上述試驗(yàn)結(jié)果較為一致，部分試驗(yàn)組DM、CP、NDF、ADF 消化率顯著或極顯著提高。奶牛對(duì)于飼糧中纖維的消化主要依靠于瘤胃內(nèi)相關(guān)纖維分解菌的作用。有研究表明，Oo 并不影響瘤胃內(nèi)真菌數(shù)量，對(duì)瘤胃內(nèi)纖維的降解并無(wú)負(fù)面影響，并可以有效地抑制瘤胃內(nèi)超級(jí)產(chǎn)氨菌數(shù)量并降低瘤胃內(nèi)NH3-N 濃度[3]，NH3-N 濃度降低的同時(shí)提高了瘤胃內(nèi)氮的留存率進(jìn)而提高奶牛對(duì)CP的利用效率。Met 是瘤胃內(nèi)微生物的主要限制性氨基酸，并且對(duì)瘤胃內(nèi)R.flavefaciens、B.fibrisolvens等纖維分解菌的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用[13]。由于RPMet過(guò)瘤胃率并非百分之百，部分溢出的Met 可能促進(jìn)了瘤胃內(nèi)部分微生物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中MH、HH 組NDF與ADF 消化率顯著提高，在RPMet 添加量最高時(shí)，Oo 的中、高添加量組飼糧纖維消化率較高，其他添加量組合有提高但與對(duì)照組相比差異不顯著。除MH 組外RPMet 中間添加量組CP 消化率依次優(yōu)于高添加量、低添加量組，Oo 并未表現(xiàn)出明顯規(guī)律。Oo 與RPMet 聯(lián)合添加時(shí)與上述試驗(yàn)相比降低了二者單獨(dú)添加時(shí)的用量。Oo 與RPMet 對(duì)瘤胃內(nèi)菌群作用原理不同，但聯(lián)合使用可以提高奶牛飼糧表觀消化率，各試驗(yàn)組中以MH組效果最好。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，奶牛飼糧中聯(lián)合添加Oo 和RPMet可以促進(jìn)瘤胃MCP 產(chǎn)量，提高飼糧主要養(yǎng)分表觀消化率。綜合考慮上述指標(biāo)，在本試驗(yàn)條件下，以O(shè)o 13 g/（d·頭）、RPMet 27.5 g/（d·頭）組合（MH 組）效果最好。