自主運動對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨形態(tài)學(xué)的影響

宗文浩 李可峰 郭煒煒 劉洋 代路路 畢軍 沙繼斌 吳燕 閆前 田雪文 董貴俊*

1.山東體育學(xué)院，山東 濟南 250102 2.山東省委黨校衛(wèi)生科，山東 濟南 250103 3.上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院，上海 200438

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種常見的退行性骨關(guān)節(jié)疾病，中老年人發(fā)病率較高，特別是肥胖的中老年人。在美國60歲及以上人群中，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)的發(fā)病率男性約為10%，女性約為13%，且隨年齡的增長及肥胖的流行而不斷提高[1]，預(yù)計到2020年，美國將有超過5千萬人遭受此病困擾，成為造成40歲以上人群殘疾及活動受限的一個重要影響因素[2]。從發(fā)病特征來看，OA最常見于髖、膝等負重關(guān)節(jié)，以關(guān)節(jié)疼痛、活動受限以及關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣鱗3]。除關(guān)節(jié)軟骨外，受累及部位還包括滑膜、韌帶、半月板以及關(guān)節(jié)周圍肌肉等[2]。對于OA的發(fā)病機制目前尚缺乏統(tǒng)一認識，受肥胖、代謝綜合征、飲食改變、靜坐少動的生活方式或運動不當?shù)取艾F(xiàn)代環(huán)境”因素影響較大[4]。傳統(tǒng)觀點認為，OA僅僅是由衰老以及運動創(chuàng)傷導(dǎo)致的機械應(yīng)力改變所引起的關(guān)節(jié)疾病，但大量的流行病學(xué)及生物學(xué)數(shù)據(jù)表明[5-9]，OA與代謝性及炎性因素密切相關(guān)，因此有學(xué)者提出“代謝性骨關(guān)節(jié)炎”(metabolic OA)的概念[10]，并將代謝性O(shè)A列為代謝綜合征(metabolic syndrome，MetS)的第五大組成部分(除肥胖、高血壓、血脂異常及高血糖外)[11]。

關(guān)節(jié)軟骨是骨關(guān)節(jié)的主要承重結(jié)構(gòu)，它覆蓋于骨關(guān)節(jié)表面，緩沖并傳導(dǎo)力學(xué)沖擊。主要由軟骨細胞及細胞外基質(zhì)構(gòu)成，內(nèi)無血管及神經(jīng)，是OA的主要病變部位[12]。目前并沒有完全治療OA的有效方法，臨床治療主要以緩解疼痛以及增加軟骨營養(yǎng)供應(yīng)為主，手術(shù)治療存在風(fēng)險大、術(shù)后并發(fā)癥多等問題[13]，因此尋找有效預(yù)防治療OA的策略是科研及臨床工作者的迫切任務(wù)。在眾多OA治療方法當中，運動訓(xùn)練以其無創(chuàng)、高效、持久的特點在OA發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，跑步是一種常見的運動方式。Jeffrey等[14]在對大鼠進行30 km/3周和55 km/6周跑步運動后發(fā)現(xiàn)，兩個周期不同距離的運動均降低了關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖含量，增加了MMP-13的表達，表明運動促進了大鼠OA的發(fā)展；而Paul等[15]研究發(fā)現(xiàn)，每周至少運動12.4 km能夠顯著降低患OA風(fēng)險?？梢?，跑步運動對OA的干預(yù)作用，尚存在較大爭議。

因此，本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6 J雄性小鼠發(fā)生膝骨性關(guān)節(jié)炎病變，從而建立骨關(guān)節(jié)炎模型，并進行3周自主轉(zhuǎn)輪運動干預(yù)，觀察運動對膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變，探究自主轉(zhuǎn)輪運動對膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨的保護作用，以期為臨床治療代謝性膝骨關(guān)節(jié)炎提供有效的實驗證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8周齡C57BL/6 J雄性小鼠28只，初始體重為(20±2)g,購自山東大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于山東體育學(xué)院動物實驗室，所有實驗操作均符合山東體育學(xué)院動物實驗倫理委員會的要求。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗動物分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后，12周齡小鼠隨機分為正常飲食組(control diet-sedentary，C-Sed組，n=6)，正常飲食加運動組(control diet-exercise，C-Ex組,n=6)，高脂飲食組(high fat diet-sedentary，HF-Sed組,n=8)以及高脂飲食加運動組(high fat diet-exercise，HF-Ex組,n=8)。C-Sed和C-Ex組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料(13.5% kcal)，HF-Sed和HF-Ex組喂養(yǎng)高脂飼料(60% kcal，貨號D12492，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供)。經(jīng)12周不同膳食干預(yù)后，參照沙繼斌[16]等的研究結(jié)果，選取HF-Sed組體重超過C-Sed組均值20%的小鼠作為肥胖小鼠模型。實驗動物單獨分籠飼養(yǎng)，自由飲食，12 h晝夜交替，環(huán)境溫度(22±1)℃，相對濕度50%～55%，每周日早上8點測空腹體重。

1.2.2運動方案：運動組小鼠喂養(yǎng)8周結(jié)束后，適應(yīng)性訓(xùn)練1周，第10周開始正式使用自主轉(zhuǎn)輪運動系統(tǒng)(圖1)計量運動量。小鼠自由運動，每轉(zhuǎn)一圈，磁感應(yīng)器計數(shù)一次，第二天早上8點記錄每只小鼠所轉(zhuǎn)圈數(shù)并清零重新計數(shù)，共計3周。

圖1 小鼠自主轉(zhuǎn)輪運動系統(tǒng)Fig.1 The voluntary wheel-running exercise system of mice

1.3 標本取材及其處理

表1 改良Mankin評分標準(總分14分)Table 1 The modified Mankin score

注：OA早期：1～6分; OA中期：7～9分;OA晚期：10～14分。

12周喂養(yǎng)結(jié)束，用乙醚麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，用咬骨鉗分別于左側(cè)膝關(guān)節(jié)上、下方各1 cm處剪斷股骨和脛骨，剔除關(guān)節(jié)周圍肌肉、韌帶以及髕骨等多余組織，注意不能傷及軟骨表面，后將整個關(guān)節(jié)浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，10% EDTA脫鈣液室溫下脫鈣4周，每3天更換一次脫鈣液，以針頭能輕松刺入骨骼視為脫鈣完全。脫鈣完成后，沿正中矢狀面將其分為內(nèi)、外側(cè)兩部分，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋，連續(xù)作4 μm切片，分別行蘇木精-伊紅(HE)、甲苯胺藍染色。

1.4 軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1HE染色：取部分石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色2 min，蒸餾水洗4 min，1%鹽酸酒精分色5 s，水洗返藍，伊紅滴染1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。HE染色主要用于觀察軟骨表面結(jié)構(gòu)是否平整，有無血管翳形成、裂隙及其嚴重程度(深達過渡層、輻射層、鈣化層，甚至脫落)；細胞的分布、數(shù)量及排列是否規(guī)則，潮線是否完整。

1.4.2甲苯胺藍染色：切片常規(guī)脫蠟至水，甲苯胺藍軟骨染色液染色1 min，鏡下體積分數(shù)95%乙醇分化數(shù)秒，風(fēng)干，二甲苯透明，中性樹膠封片。甲苯胺藍染色主要用于觀察軟骨基質(zhì)失染程度，即軟骨蛋白多糖含量。

1.4.3OA關(guān)節(jié)軟骨退變程度評價：根據(jù)改良Mankin評分標準[17]，由兩名觀察者采用雙盲法對各組HE及甲苯胺藍染色切片進行評分，取兩者平均值作為最后得分?？偡譃?4分，得分越高表明OA關(guān)節(jié)軟骨退變程度越高(表1)。

1.4.4脛骨透明軟骨層厚度測量：每隔100 μm取一張切片進行HE染色，每個樣本分別于內(nèi)、外側(cè)各取3張切片，測量脛骨透明軟骨層(從軟骨表面至潮線表面)厚度。在40倍光鏡下，以脛骨平臺負重區(qū)為中心[18]，左右每隔25 μm各取五點，共取11點，分別測量各點透明軟骨厚度，最后取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 研究結(jié)果

2.1 飲食及運動對C57BL/6 J小鼠體重、運動距離的影響

如圖2所示，12周不同膳食干預(yù)后，HF-Sed組8只小鼠中有6只體重超過C-Sed組體重均值(27.8 g)的20%，即大于33.4 g，HF-Sed組小鼠平均體重是C-Sed組小鼠平均體重的1.36倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),表明12周高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6 J小鼠發(fā)生了肥胖；就運動而言，與HF-Sed組相比,HF-Ex組小鼠體重明顯降低，兩者之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),表明3周自主轉(zhuǎn)輪運動起到了降低體重的作用，但正常飲食組之間比較差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。盡管高脂飲食顯著提高了HF-Sed組小鼠體重，但卻未能明顯改變其運動距離。如圖3結(jié)果顯示，C-Ex組與HF-Ex組兩組小鼠運動距離相似，兩者之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明不同膳食沒有對小鼠的運動距離產(chǎn)生影響。

圖4 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)染色結(jié)果 圖a～圖d為各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色(40×)，圖e～圖h為甲苯胺藍染色(40×)。Fig.4 Morphological results of knee joint cartilage in different groups of mice

圖2 各組小鼠體重變化(與C-Sed組比較，**P<0.01；與HF-Sed組比較，##P<0.01)Fig.2 The body weight change of mice in different groups

圖3 兩組小鼠每天平均運動距離比較Fig.3 The average daily exercise distance of the two groups of mice

2.2 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)染色結(jié)果

C-Sed組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，細胞排列整齊，四層結(jié)構(gòu)清晰，潮線完整無缺失，基質(zhì)染色正常，軟骨厚度適中；C-Ex組較C-Sed組軟骨細胞增多；HF-Sed組與C-Sed組相比，軟骨表面不規(guī)則，有裂隙出現(xiàn)，細胞排列紊亂，軟骨基質(zhì)淡染，部分潮線缺失，尤以股骨最為明顯；HF-Ex組軟骨表面較光滑，細胞排列較規(guī)則，軟骨基質(zhì)中度失色。見圖4。

2.3 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分結(jié)果比較

圖5 小鼠各部位關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分結(jié)果(*P<0.05;**P<0.01)Fig.5 Mankin score of articular cartilage in different parts of joints

對小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨、內(nèi)側(cè)股骨、外側(cè)脛骨以及外側(cè)股骨四個部位關(guān)節(jié)軟骨進行Mankin評分，探究飲食及運動對小鼠關(guān)節(jié)軟骨退變的影響。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，由飲食及運動引起的最大改變是在小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)部分，高脂飲食增加了其內(nèi)側(cè)部分的Mankin評分分值(圖5 A,圖5B)，雖然在外側(cè)部分Mankin評分升高，但只在外側(cè)脛骨C-Sed與HF-Sed兩組之間有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5C,圖5D)；3周自主轉(zhuǎn)輪運動降低了小鼠膝關(guān)節(jié)脛骨內(nèi)側(cè)的Mankin評分分值(P<0.05)。

2.4 各組小鼠膝關(guān)節(jié)脛骨內(nèi)外側(cè)透明軟骨層厚度比較

從表2中可以看出，與C-Sed組相比，高脂飲食引起了HF-Sed組小鼠膝關(guān)節(jié)脛骨內(nèi)外側(cè)透明軟骨的顯著性改變,其中以內(nèi)側(cè)改變最為明顯(P<0.001)；施加運動干預(yù)后，與C-Sed組相比，C-Ex組小鼠內(nèi)側(cè)軟骨厚度有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義，外側(cè)軟骨厚度基本保持不變(P<0.05)；HF-Sed組與HF-Ex組兩者內(nèi)側(cè)透明軟骨厚度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明自主轉(zhuǎn)輪運動阻止了HF-Ex組小鼠軟骨厚度的進一步降低，延緩了其軟骨退變進程。

表2 各組小鼠膝關(guān)節(jié)脛骨內(nèi)外側(cè)透明軟骨厚度比較Table 2 Thickness of hyaline cartilage in medial and lateral tibia of knee joint in different

注：與C-Sed組比較，*P<0.05，***P<0.001；與HF-Sed組比較，###P<0.001。

3 討論

3.1 高脂飲食及運動對C57BL/6 J小鼠體重、運動能力的影響

隨著人們生活水平的不斷提高、生活習(xí)慣及膳食結(jié)構(gòu)的改變、大量高糖高脂膳食攝入及運動量的減少，致使肥胖人群不斷增加，大量研究表明[19-21]，肥胖是誘發(fā)高血壓、糖尿病、心血管病以及骨關(guān)節(jié)病等慢性疾病的罪魁禍首。本研究通過12周高脂飲食，發(fā)現(xiàn)高脂飲食組小鼠體重明顯高于正常飲食組，成功建立了動物肥胖模型，且經(jīng)3周自主轉(zhuǎn)輪運動干預(yù)后，高脂飲食加運動組小鼠體重明顯減輕，提示運動起到了降低體重、減肥的作用。但Griffin等[3]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4周自主轉(zhuǎn)輪運動并未使高脂飲食加運動組小鼠體重降低，造成結(jié)果不一致的原因可能是本研究高脂飲食加運動組小鼠每天運動距離大于上述研究，能量消耗較高。在相同運動時間內(nèi)，正常飲食加運動組小鼠與正常飲食組相比，體重?zé)o較大改變，很可能是由于正常飲食組小鼠體重本身處于正常范圍內(nèi)，3周運動增強了其肌肉含量，并未起到降體重的作用。Takamine等[22]研究結(jié)果顯示，肥胖組與正常組兩組大鼠自主轉(zhuǎn)輪運動總距離之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與本研究結(jié)果相類似，結(jié)果提示高脂飲食并未使小鼠運動能力發(fā)生改變，這好像有悖于常理。以往研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，體重與身體活動水平呈負相關(guān)，也就是說，體重越大者，身體活動水平越低，分析其中的原因，可能是由于高脂飲食喂養(yǎng)時間較短，造成的肥胖程度較低，因而未達到活動受限的程度。但也有研究發(fā)現(xiàn)，身體活動水平與體重之間并不存在明確的關(guān)聯(lián)，例如，王歡等[25]通過對中老年肥胖男性身體活動水平與能量消耗特征研究發(fā)現(xiàn)，肥胖人群的身體活動量和每日消耗能力并不低于體重正常組。

3.2 高脂飲食及運動對小鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

肥胖與OA是世界范圍內(nèi)普遍存在的兩大健康問題，肥胖在OA發(fā)生發(fā)展中的作用已得到許多研究結(jié)果的證實，肥胖除增加個體負重關(guān)節(jié)負荷外，代謝因子紊亂也是誘發(fā)OA的主要因素[26]。本研究的目的在于通過高脂飲食誘導(dǎo)小鼠發(fā)生膝骨關(guān)節(jié)炎并進行3周自主轉(zhuǎn)輪運動，以探究自主運動對膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善作用。近期研究表明[27-28]，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖能夠?qū)е玛P(guān)節(jié)軟骨OA樣改變，且能夠加速OA發(fā)展進程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12周高脂飲食喂養(yǎng)后，高脂飲食組小鼠軟骨表面出現(xiàn)纖維樣改變，嚴重者表面軟骨層缺失，HE染色結(jié)果顯示潮線不完整且軟骨細胞減少，透明軟骨層厚度降低，甲苯胺藍染色淡染即蛋白多糖減少，與Mankin評分結(jié)果相一致，結(jié)果提示12周高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6 J小鼠早期OA的發(fā)生。Mankin評分結(jié)果以及透明軟骨層厚度測量結(jié)果顯示，高脂飲食所造成的最大改變是在內(nèi)側(cè)部分，與前人[3]研究結(jié)果一致，造成KOA軟骨內(nèi)外側(cè)嚴重程度差異的機制尚不完全清楚，盡管一些研究[29]發(fā)現(xiàn)這可能與內(nèi)外側(cè)髁受力不均勻有關(guān)。

本研究采用自主轉(zhuǎn)輪運動，讓小鼠在自由狀態(tài)下進行轉(zhuǎn)輪運動，試圖模擬動物以及人類在自由狀態(tài)下進行運動的效應(yīng)。結(jié)果顯示，兩組小鼠每天運動距離之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，運動距離適中。與跑臺等強迫性運動相比，自主轉(zhuǎn)輪運動較為隨意，運動訓(xùn)練過程不受外界控制，即運動負荷強度無法人為調(diào)節(jié)?？偟膩碚f，3周自主轉(zhuǎn)輪運動對小鼠關(guān)節(jié)軟骨的影響是適度的，運動并沒有增加由飲食引起的肥胖小鼠膝關(guān)節(jié)任何部位OA評分的增加，但在內(nèi)側(cè)脛骨部分，運動延緩了OA的進展。關(guān)節(jié)軟骨是附著于關(guān)節(jié)表面的一層結(jié)締組織，主要由軟骨細胞及細胞外基質(zhì)構(gòu)成，內(nèi)無血管、淋巴管及神經(jīng)組織，自我修復(fù)能力差[30]。關(guān)于運動對關(guān)節(jié)軟骨的作用，目前普遍認為，一定強度的運動負荷刺激能夠維持關(guān)節(jié)軟骨正常生理特性[31],而缺乏運動，比如長期關(guān)節(jié)制動能夠?qū)е玛P(guān)節(jié)軟骨機械特性的下降以及蛋白聚糖含量丟失，最終造成關(guān)節(jié)軟骨中度降解[32]。在Tee等[29]的研究中，給予高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠6周低強度振動刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨厚度顯著增加，與本研究結(jié)果相類似，相較于HF-Sed組，3周自主轉(zhuǎn)輪運動明顯增加了HF-Ex組小鼠內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨透明軟骨層厚度，外側(cè)無較大變化。在正常飲食組，運動雖未引起透明軟骨層厚度顯著性增加，但與C-Sed組相比，C-Ex組小鼠透明軟骨層厚度增加6.5%。以上結(jié)果提示，3周自主轉(zhuǎn)輪運動對關(guān)節(jié)軟骨所造成的影響是積極的。

當然，本實驗也存在局限性。首先，本研究并未探討造成KOA的原因，且由于3周自主轉(zhuǎn)輪運動降低了HF-Ex組小鼠體重，因此不能排除體重降低對運動延緩OA進程的干擾，這一點不是很理想。但運動后C-Ex組小鼠體重并未降低，且膝關(guān)節(jié)脛骨內(nèi)側(cè)透明軟骨厚度增加，表明3周自主轉(zhuǎn)輪運動對軟骨的影響是有利的。此外，KOA是一種全關(guān)節(jié)疾病，若將軟骨下骨等其它部位參數(shù)考慮在內(nèi)，將有助于進一步揭示飲食及運動對KOA的影響。

4 小結(jié)

12周高脂飲食喂養(yǎng)可誘導(dǎo)C57BL/6 J小鼠肥胖并發(fā)生膝骨性關(guān)節(jié)炎，3周自主轉(zhuǎn)輪運動干預(yù)在一定程度上延緩并改善了由高脂飲食引起的膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。本文主要探討了飲食及運動對膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)的影響，但究其變化機制需要在今后的研究當中進一步探索。