龜板有效成分對小鼠毛囊生長和毛發(fā)生長周期的影響

鐘淑賢　石雨晴　楊亞蘭　申倩　胡佩欣　李春

[摘要]目的：觀察龜板有效成分對脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)生長及周期的影響。方法：制作小鼠休止期脫毛模型。脫毛后分組，其中陽性對照組予5%米諾地爾溶液、實驗A、B、C組分別予0.15%、0.2%、0.4%龜板有效成分溶液外用于脫毛區(qū)。比較各組小鼠毛發(fā)生長差異，且在實驗第19天切取小鼠背部脫毛區(qū)皮膚作HE染色及毛囊計數(shù)，觀察龜板有效成分對毛囊數(shù)量的影響。結(jié)果：適當濃度的實驗B組與陽性對照組的小鼠毛發(fā)生長優(yōu)先于其他組;實驗組小鼠毛囊毛干色素深，以終毛為主;實驗組小鼠背部脫毛區(qū)皮膚毛囊數(shù)量比模型組多（P<0.05），有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：龜板有效成分能促進毛發(fā)和毛囊生長，延長毛發(fā)生長期。

[關(guān)鍵詞]龜板有效成分;休止期脫發(fā);毛發(fā)生長;毛發(fā)周期;毛囊

[中圖分類號]R329.2+8? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）10-0096-03

Abstract： Objective? To observe the effects of the effective components of tortoise shell on hair growth and cycle of hair loss model mice. Methods? The model of hair loss of telogen in mice was made. After depilation， positive control group were given 5% minoxidil solution and experimental group A， B， C were given 0.15%， 0.2%， 0.4% tortoise shell effective components solution respectively for the hair removal area. Comparison of hair growth differences between groups. The skin of the back hair of the mice was excised for HE staining and hair follicle count on the 19th day of the experiment， and the effect of the effective components of tortoise shell on the number of hair follicles was observed. Results? Appropriate concentration of experimental group B and positive control mice hair growth prior to other groups. The hair shaft colour of hair follicle of experimental mice were deep， which mainly were terminal hair. The number of hair follicles in the back depilation area of the experimental group was higher than that of the model group （P<0.05）， which was statistically significant. Conclusion? The effective components of tortoise shell promote the growth of hair and hair follicles and prolong the hair anagen.

Key words： effective components of tortoise shell; hair loss of telogen; hair growth; hair growth cycle; hair follicles

龜板味甘、咸、性寒，歸肝、腎、心經(jīng)，《本草綱目》記載“龜甲以補腎添精、補血滋陰為用”，具有補腎填精、滋陰潛陽、益腎健骨之功效。十四酸甾醇酯（Cholesterol Myristate， S8）和甾酮（（+）-Cholesten-3-one， S9）是龜板乙酸乙酯提取物中最具生物活性的單體[1]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，龜板有效成分在促進大鼠傷口愈合的同時，促進了毛發(fā)的生長?；谀I“其華在發(fā)”理論，通過對腎臟的調(diào)理，本文探討龜板有效成分對毛發(fā)的作用，旨在進一步深入研究龜板的功效。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：5～6周齡雄性C57BL/6J小鼠（SPF級），廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2018-0034。

1.2 主要試劑：米諾地爾購于上海易勢化工有限公司，貨號：RC503218;（+）-4-Cholesten-3-one（S9）購于Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.貨號：C1366。

1.3 方法

1.3.1 小鼠脫發(fā)模型建立：小鼠分籠飼養(yǎng)1周后，將松香和石蠟按1：1比例加熱混合融化后，均勻涂抹于小鼠背部，面積為2cm×2cm，冷卻凝固后揭去，以去除背毛。小鼠的皮膚在毛發(fā)生長期呈黑色，退行期呈灰色，休止期呈粉紅色[2]。揭毛后確認毛發(fā)處于生長周期中的休止期，皮膚顏色為粉紅色。

1.3.2 動物分組及干預(yù)：脫毛后，選取脫毛區(qū)皮膚光滑無皮損的小鼠，隨機分為模型組6只、陽性對照組6只、實驗A組6只，實驗B組6只，實驗C組6只。干預(yù)措施分別為：①模型組：造模不給藥;②陽性對照組：造模后，給予5%米諾地爾外用，每天早上1次;③實驗A組：造模后，給予0.15%龜板有效成分溶液外用;④實驗B組：造模后，給予0.2%龜板有效成分溶液外用;⑤實驗C組：造模后，給予0.4%龜板有效成分溶液外用，實驗組給藥早晚1次。連續(xù)給藥19d。

1.3.3 觀察記錄結(jié)果：每天觀察小鼠脫毛區(qū)皮膚顏色和毛發(fā)生長情況，并定期拍照。第19天，取各組小鼠背部脫毛區(qū)皮膚組織塊，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進行HE染色，光鏡下觀察，每張片在高倍鏡下選取3個視野進行毛囊計數(shù)，每個視野盡量不重疊。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析：采用Stata/MP 13.1統(tǒng)計軟件進行方差分析，兩兩比較的Bonferroni法分析數(shù)據(jù)，均數(shù)與標準差表示計量資料。

2? 結(jié)果

2.1 不同濃度的龜板有效成分對毛發(fā)生長的影響：小鼠均在脫毛后第5～6天局部皮膚逐漸變黑，毛發(fā)進入生長期。第9天時，實驗B組與陽性對照組已長出毛發(fā)。此外，第10天時，低、高濃度的實驗A、C組的毛發(fā)生長速度明顯落后于適當濃度的實驗B組，甚至落后于毛發(fā)自然生長的模型組。各組小鼠毛發(fā)生長情況見圖1。

2.2 組織學(xué)檢查

2.2.1 實驗第19天，切取每組小鼠背部皮膚，石蠟切片，HE染色進行觀察：陽性對照組和實驗組視野范圍內(nèi)毛囊數(shù)量明顯比模型組多。實驗組毛干色素深，以終毛為主，模型組與陽性對照組毛干色素淺甚至無，以毳毛為主。各組小鼠背部皮膚HE染色（400×）見圖2。

2.2.2 龜板有效成分對毛囊數(shù)量的影響：實驗第19天，各組小鼠毛囊數(shù)量見表1。按α=0.01水準，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=5.61，P=0.0023，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，故模型組、陽性對照組和實驗組涂抹的藥物對毛囊數(shù)量的影響不完全相同。進一步進行兩兩比較，模型組與實驗A組、實驗B組、實驗C組比較，P=0.015、P=0.005、P=0.011，均P<0.05，故模型組與實驗組具有顯著性差異，尤以實驗B組差異最大。

3? 討論

龜板是一味補腎健骨的傳統(tǒng)中藥，具有促進成骨分化、保護神經(jīng)系統(tǒng)、促進創(chuàng)傷修復(fù)等功能。研究表明，龜板提取物可能促進神經(jīng)干細胞向多巴胺神經(jīng)元分化[3];促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化[4];對多發(fā)性抽動癥有良好的治療作用[5];防治糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨量丟失、骨質(zhì)量的損害及骨生物力學(xué)的減弱、骨形態(tài)的破壞和小梁骨表面破骨[6];還可能通過調(diào)控毛囊干細胞促進SD大鼠壓瘡創(chuàng)面修復(fù)[7]。目前國內(nèi)外可見龜板對毛囊干細胞增殖影響的研究，未見龜板對毛發(fā)生長影響的相關(guān)報道。在正常的生理情況下，毛囊干細胞參與毛囊與毛發(fā)的再生。本研究以C57BL/6J小鼠為模型，設(shè)立模型組、陽性對照組和不同濃度的實驗組，觀察外用龜板提取物溶液對毛發(fā)生長、毛囊數(shù)量等影響。

米諾地爾溶液是臨床應(yīng)用極為廣泛的一種治療各類脫發(fā)的藥物，它能夠延長毛發(fā)生長期，縮短休止期，提高生長期/退行期的比例，舒張血管，增加局部血供，為毛囊提供更多的養(yǎng)分，促進毛發(fā)生長[8]。根據(jù)診療指南[9-10]，推薦男性患者使用5%米諾地爾，故本研究選用5%米諾地爾溶液為陽性對照。

本研究發(fā)現(xiàn)，實驗B組與陽性對照組優(yōu)先長出了毛發(fā)，低、高濃度的實驗A、C組的毛發(fā)生長速度落后于適當濃度的實驗B組，表明適當濃度的龜板有效成分可能與米諾地爾一樣具有促進毛發(fā)生長作用。小鼠毛發(fā)呈黑色，皮膚中的黑素細胞均分布于毛囊，僅在毛發(fā)生長期才合成分泌黑素，并將黑素傳遞給角質(zhì)形成細胞，使皮膚呈黑色，因此觀察小鼠毛囊數(shù)量以及色素深淺是判斷小鼠毛發(fā)生長狀況的重要依據(jù)。從第19天小鼠背部皮膚HE染色和毛囊計數(shù)可觀察到實驗組毛囊數(shù)量普遍比模型組多，毛干色素深，以終毛為主，表明龜板有效成分能促進毛囊生長，使毛發(fā)持續(xù)處于生長期，延長毛發(fā)生長期。

本研究結(jié)果顯示龜板有效成分能促進毛發(fā)和毛囊生長，延長毛發(fā)生長期，但由于人與動物有著種屬差異，龜板有效成分是否具有促進人毛發(fā)生長作用還未知，此外其促毛發(fā)生長的機制也有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]田瑞敏.龜板有效成分調(diào)控毛囊干細胞Wnt/BMP信號及其對壓瘡的影響[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[2]李云飛，林佩，賀嫣然，等.天然藥物對毛發(fā)生長影響因素調(diào)節(jié)作用的研究進展[J].中草藥，2014，45（11）：1655-1662.

[3]周笑莉，劉憶思，陳東風，等.龜板提取物調(diào)控Otx2基因促進神經(jīng)干細胞向多巴胺神經(jīng)元分化的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28（2）：171-176.

[4]沈耿楊.龜板有效成分調(diào)節(jié)let-7f靶向TNFR2促BMSCs成骨分化的機制研究[C].中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會骨傷科學(xué)術(shù)年會，2017：2.

[5]方錦穎，陳琪，國文文，等.龜板對多發(fā)性抽動癥模型大鼠的干預(yù)作用與對DA及D2受體的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2016，9（7）：781-784.

[6]任輝.龜板防治GIOP中miRNA調(diào)控Wnt/β-catenin通路的機理研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[7]李春，田瑞敏，李瑜，等.龜板提取物調(diào)控毛囊干細胞Wnt/BMP信號通路促進大鼠壓瘡修復(fù)[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，36（1）：87-93.

[8]王璇，王瑾.雄激素源性脫發(fā)的機制及藥物治療進展[J].臨床醫(yī)藥文獻雜志，2018，5（33）：186-188.

[9]張建中.中國雄激素性禿發(fā)診療指南[J].臨床皮膚科雜志，2014，43（3）：182-186.

[10]Motomu MANABE，Ryoji TSUBOI，Satoshi ITAMI，et al.Guidelines for the diagnosis and treatment of male-pattern and female-pattern hair loss，2017 version[J].J Dermatol，2018，45（9）：1-13.

[收稿日期]2019-03-25

本文引用格式：鐘淑賢，石雨晴，楊亞蘭，等.龜板有效成分對小鼠毛囊生長和毛發(fā)生長周期的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（10）：96-98.