弓形蟲(chóng)ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白對(duì)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響

金 郁，計(jì)永勝，姚 湧，汪學(xué)龍

胚胎植入是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到子宮與胚胎之間精確的相互作用。當(dāng)胚胎附著在子宮內(nèi)膜上后，在植入部位的基質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生蛻膜化[1]。子宮蛻膜化對(duì)胚胎的植入和妊娠的維持至關(guān)重要。如果產(chǎn)婦子宮不經(jīng)過(guò)蛻膜化，胚胎就不會(huì)正常發(fā)育。小鼠子宮蛻膜細(xì)胞在胚胎植入后以有序的凋亡和增殖來(lái)適應(yīng)其快速生長(zhǎng)發(fā)育的需要，現(xiàn)已證明，蛻膜細(xì)胞的增殖與退化是一個(gè)涉及多種因素的細(xì)胞凋亡過(guò)程[2-3]。在這個(gè)過(guò)程中，子宮內(nèi)膜基質(zhì)的增殖和凋亡需要嚴(yán)格遵循時(shí)空的發(fā)展。有研究[4]顯示，小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中的凋亡受到促進(jìn)和抑制作用，都會(huì)導(dǎo)致蛻膜化的異常，導(dǎo)致著床位點(diǎn)的減少，引起著床的失敗。

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種屬于真球蟲(chóng)目(Eucoccidiorid)、弓形蟲(chóng)科(Toxoplasmatidae)、弓形蟲(chóng)屬(Toxoplasma)的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，根據(jù)蟲(chóng)體對(duì)小鼠毒力的差異可以將弓形蟲(chóng)分為3型。弓形蟲(chóng)ROP16蛋白同樣在不同蟲(chóng)株間存在多態(tài)性。I型和III型蟲(chóng)株(如RH、CTG)ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白可以通過(guò)直接和宿主細(xì)胞的STAT3結(jié)合，磷酸化STAT 705位的酪氨酸。目前有研究[5]表明其對(duì)宿主細(xì)胞的凋亡具有抑制作用。同時(shí)，ROP16Ⅰ/Ⅲ會(huì)誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生凋亡[6]。而ROP16Ⅰ/Ⅲ對(duì)于蛻膜細(xì)胞的影響鮮有報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒感染原代小鼠蛻膜細(xì)胞，檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)，探討弓形蟲(chóng)ROP16蛋白對(duì)妊娠小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HYCLONE公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、RIPA裂解液、一抗稀釋液、ECL Kit化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)公司；膠原酶Ⅱ、NC膜均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Western blot所用一抗anti-Bax、anti-Bcl-2、anti-Caspase3均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；二抗HRP羊抗兔、免疫熒光一抗anti-Vimentin、二抗羊抗兔均購(gòu)自武漢博士德公司；流式細(xì)胞術(shù)凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；E2、P4、cAMP試劑購(gòu)自美國(guó)阿拉丁公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡清潔級(jí)昆明小鼠均為性成熟雌、雄鼠，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。小鼠的飼養(yǎng)以安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南為標(biāo)準(zhǔn)，符合動(dòng)物倫理相關(guān)準(zhǔn)則。雌、雄鼠按2 ∶1合籠，次晨發(fā)現(xiàn)陰栓者記為孕D0。

1.2 小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)取孕D4的雌鼠的子宮，剪凈系膜和多余脂肪，放入培養(yǎng)皿，用PBS沖洗2次后，將子宮剪碎，過(guò)程中可適當(dāng)加入少量胰酶繼續(xù)剪，最終以約1只0.7 ml的體積加入胰酶。將加好酶液的培養(yǎng)皿在4 ℃放置1 h，再室溫1 h，然后用含10% FBS的培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)入15 ml離心管，500 r/min離心5 min。然后用PBS洗滌沉淀1次，500 r/min離心5 min，棄上清液，然后加入配好的0.5%膠原酶Ⅳ，混勻，放入恒溫?fù)u床，37 ℃消化30 min。然后終止消化，將組織液依次通過(guò)200目和400目的滅菌過(guò)濾網(wǎng)，收集濾液到50 ml的離心管，1 500 r/min離心5 min后用PBS洗滌沉淀，后1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基，重懸沉淀，計(jì)數(shù)后以1×105個(gè)/ml接種于6孔板。將細(xì)胞在培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，等基質(zhì)細(xì)胞貼壁后換液去除雜細(xì)胞。

1.3 小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞純度鑒定將上述步驟取得的原代子宮基質(zhì)細(xì)胞做細(xì)胞爬片，PBS洗3次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定30 min后用PBS洗3次，用5%BSA封閉，37 ℃ 1 h，接著加入Vimentin抗體(1 ∶100)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次。然后加熒光二抗(FITC標(biāo)記二抗，1 ∶50)，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次。最后加入DAPI染核(1 ∶25)，室溫15 min，PBS洗3次，加入熒光猝滅劑后封片。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光信號(hào)。

1.4 ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒感染小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞并體外誘導(dǎo)蛻膜化培養(yǎng)小鼠原代子宮基質(zhì)細(xì)胞24 h后，用ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒進(jìn)行細(xì)胞感染，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、空載慢病毒組和ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒轉(zhuǎn)染組。慢病毒轉(zhuǎn)染24 h后在培養(yǎng)基中加入1 μmol/L孕激素(P4)、10 nmol/L雌二醇(E2)、0.5 mmol/L環(huán)磷酸腺苷(cAMP)進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。并接著培養(yǎng)48 h，分別收集0、24、48 h的蛻膜細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光染料法，以β-actin為內(nèi)參，以比較Ct值法進(jìn)行相對(duì)定量,觀察催乳素(prolactin,PRL) mRNA表達(dá)水平。PRL基因上游引物為5′-CTCCTCCTGTTGCTGA-3′，下游引物為5′-CAGTCGG GTCTTTCCC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為362 bp。內(nèi)參基因β-actin上游引物為5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游引物為5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′， 擴(kuò)增長(zhǎng)度為228 bp。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒并體外誘導(dǎo)蛻膜化72 h后，收集各組細(xì)胞，用胰酶消化下來(lái)后，用PBS和緩沖液依次洗滌后按凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率。

1.6 Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平收集細(xì)胞總蛋白，用SDS-PAGE電泳分離蛋白(20 μg/孔)，轉(zhuǎn)至PVDF膜，按順序孵育抗體(一抗?jié)舛染鶠? ∶1 000，二抗?jié)舛葹? ∶5 000)，顯色。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞純度鑒定采用免疫熒光方法檢測(cè)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)，鑒定其純度，熒光顯微鏡下觀察，Vimentin蛋白主要集中于胞質(zhì)，產(chǎn)生綠色熒光，用DAPI染核，產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光。顯微鏡視野下隨機(jī)選取5個(gè)不同區(qū)域，計(jì)數(shù)波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比，結(jié)果顯示，提取的原代基質(zhì)細(xì)胞純度為(95±2.5)%。見(jiàn)圖1。

2.2 成功誘導(dǎo)細(xì)胞蛻膜化在培養(yǎng)基中加入E2、P4和cAMP培養(yǎng)原代基質(zhì)細(xì)胞，小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞人工誘導(dǎo)蛻膜化后，分別在0、24、48 h測(cè)定PRL mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，隨著體外誘導(dǎo)蛻膜化時(shí)間的延長(zhǎng)，PRL mRNA的表達(dá)會(huì)逐漸增加(P<0.05)，說(shuō)明體外誘導(dǎo)蛻膜化成功。見(jiàn)圖2。

圖1 小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的鑒定 ×200

A：熒光顯微鏡下觀察間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin蛋白；B：熒光顯微鏡下觀察DAPI染色的細(xì)胞核；C：合并觀察計(jì)數(shù)波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)

圖2 小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化 ×200

A：明場(chǎng)下觀察小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞；B：經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)蛻膜化后，明場(chǎng)下觀察蛻膜細(xì)胞；C：小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化qRT-PCR測(cè)定PRL mRNA表達(dá)；與24 h比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 ROP16Ⅰ/Ⅲ重組慢病毒感染小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞 ×200

A：明場(chǎng)下轉(zhuǎn)染ROP16Ⅰ/Ⅲ過(guò)表達(dá)重組慢病毒的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞；B：熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染ROP16Ⅰ/Ⅲ過(guò)表達(dá)重組慢病毒的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞；C：明場(chǎng)下轉(zhuǎn)染空載病毒的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞；D：熒光顯微鏡下空載病毒轉(zhuǎn)染的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞；E：明場(chǎng)下的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞；F：熒光顯微鏡下的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞

2.3 慢病毒成功轉(zhuǎn)染蛻膜細(xì)胞培養(yǎng)的原代小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞分別感染ROP16Ⅰ/Ⅲ基因過(guò)表達(dá)和空載LV慢病毒并體外誘導(dǎo)蛻膜化培養(yǎng)72 h后，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。見(jiàn)圖3。

2.4 ROP16Ⅰ/Ⅲ對(duì)蛻膜細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：ROP16Ⅰ/Ⅲ過(guò)表達(dá)組的蛻膜細(xì)胞凋亡率相較于空載組(F=111.4,P<0.01)和對(duì)照組(F=49.1,P<0.01)降低。見(jiàn)圖4。

2.5 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平后顯示：各組細(xì)胞在培養(yǎng)72 h后，對(duì)照組和空載組的Bax、bcl-2蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯差異，而ROP16Ⅰ/Ⅲ轉(zhuǎn)染組Bax表達(dá)較對(duì)照組和空載組降低，Bcl-2表達(dá)較對(duì)照組和空載組則呈升高趨勢(shì),因此ROP16Ⅰ/Ⅲ轉(zhuǎn)染組Bax/Bcl-2的值小于對(duì)照組(F=75.22,P<0.05)和空載組(F=51.13，P<0.05)。見(jiàn)圖5。

3 討論

胚泡和子宮是結(jié)構(gòu)成分不同的兩種組織，植入是胚胎與子宮建立生理聯(lián)系的過(guò)程，是胚泡和子宮相互識(shí)別、黏附、容納的過(guò)程，所以植入是妊娠過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，稱為“植入窗口期”。植入過(guò)程中，子宮內(nèi)膜和胚泡的滋養(yǎng)層都會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的變化：植入位點(diǎn)的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞首先會(huì)發(fā)生劇烈的增殖和分化，這種變化會(huì)逐漸延伸到整個(gè)子宮內(nèi)膜。這些變化統(tǒng)稱為子宮蛻膜化。

圖4 各組基質(zhì)細(xì)胞感染不同ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒的凋亡率

A：ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒轉(zhuǎn)染組；B：陰性對(duì)照病毒組；C：對(duì)照組；D：各組凋亡率；與空載組比較：**P<0.01；與對(duì)照組比較：##P<0.01

圖5 Western blot法檢測(cè)Bax和Bcl-2表達(dá)與空載組比較：*P<0.05；與對(duì)照組比較：#P<0.05

子宮內(nèi)膜進(jìn)行蛻膜化的過(guò)程中，首先與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的正常增殖密切相關(guān)[7]。當(dāng)胚泡附著在子宮內(nèi)膜上皮時(shí)，在附著位置周圍的內(nèi)膜上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，而鄰近的基質(zhì)細(xì)胞則會(huì)進(jìn)行廣泛的增殖，增殖的基質(zhì)細(xì)胞獲得多倍性而分化成特殊的細(xì)胞類型，此時(shí)基質(zhì)細(xì)胞會(huì)向著床位點(diǎn)周圍擴(kuò)展，逐步形成成熟的蛻膜細(xì)胞，然后隨著胚泡的植入，又會(huì)按照相同的趨勢(shì)持續(xù)退化和凋亡[8]，并被周圍的滋養(yǎng)層或巨噬細(xì)胞吞噬[9]。因?yàn)橛辛送懩せ^(guò)程中細(xì)胞有序的增殖和退化，使胚泡周圍的蛻膜細(xì)胞的數(shù)量得以控制，所以控制了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲。在此過(guò)程中，小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)和分子水平的獨(dú)特變化[10]。蛻膜化過(guò)程中，著床位點(diǎn)的蛻膜細(xì)胞停止增殖，終末分化后形成的區(qū)域稱之為初級(jí)蛻膜區(qū),第2次分化形成的區(qū)域稱之為次級(jí)蛻膜區(qū)，最后次級(jí)蛻膜區(qū)的細(xì)胞也會(huì)發(fā)生凋亡，使著床位點(diǎn)的腔隙增大以便容納生長(zhǎng)的胚胎[11]。

在本實(shí)驗(yàn)中，在孕鼠胚胎著床的時(shí)間段成功分離培養(yǎng)了子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，在體外培養(yǎng)的小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白，并體外誘導(dǎo)蛻膜化時(shí)，結(jié)果顯示ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白上調(diào)了蛻膜細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)并降低了Bax表達(dá)，抑制了蛻膜細(xì)胞的凋亡，提示可能導(dǎo)致初級(jí)蛻膜區(qū)的蛻膜細(xì)胞不能按照正常程序退化消失，同時(shí)段發(fā)育的胚胎不能獲得足夠相應(yīng)的發(fā)展空間，同時(shí)，初級(jí)蛻膜區(qū)退化的受阻也會(huì)導(dǎo)致次級(jí)蛻膜區(qū)的發(fā)展受阻，也會(huì)導(dǎo)致接下來(lái)胚胎發(fā)展空間的受限，最終導(dǎo)致母胎界面的對(duì)話受到干擾，從而導(dǎo)致植入位點(diǎn)的數(shù)量減少，引起胚胎著床的不良結(jié)局。

ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白作為弓形蟲(chóng)重要毒力因子，具有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸激酶活性，參與宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)錄活化因子(STATs)相關(guān)的磷酸化[12]。由于ROP16Ⅰ/Ⅲ能磷酸化STAT3，兩者作用后會(huì)從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核引起下游轉(zhuǎn)錄因子改變，結(jié)果就會(huì)干預(yù)宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)[13-14]。磷酸化的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，直接與DNA結(jié)合，誘導(dǎo)抗凋亡蛋白(Bcl-xL、Mcl-1、survivin)的表達(dá)，所以STAT3通路的活化在多種細(xì)胞都有抗凋亡的作用[15]。 ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白可以通過(guò)磷酸化STAT3，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡變化。ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白在蛻膜細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中抑制了細(xì)胞的凋亡，其中與細(xì)胞其他促凋亡因子之間的相互作用機(jī)制及信號(hào)通路和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)于不良妊娠的驗(yàn)證是本研究下一步的研究方向和內(nèi)容。